【关键词】 脊髓
［摘要］ 目的 研究大鼠脑和脊髓损伤后骨折股骨骨痂中神经生长因子（NGF）表达的变化。方法 成年健康雌性Wistar大鼠48只，随机分为单纯股骨骨折组、股骨骨折并脑损伤组和股骨骨折并脊髓损伤组，每组16只，每组再分为骨折后1、4、7、14 d观察组。应用自由坠落重物撞击法建立脑和脊髓损伤动物模型，免疫组织化学方法检测各组骨痂中NGF的表达。结果 单纯骨折组表现为典型的骨折愈合过程，骨痂内纤维母细胞及成骨细胞内NGF阳性表达相对较弱。骨折并脑损伤组早期纤维性骨痂形成较慢，骨折早期骨痂内成纤维细胞及成骨细胞NGF表达较弱，第14天表达增强，出现成骨细胞。骨折并脊髓损伤组早期形成大量纤维骨痂和软骨骨痂，NGF强阳性表达，第14天已有编织骨形成，NGF表达达高峰。结论 并发脊髓损伤的股骨骨折愈合较快，NGF表达明显增强，提示NGF可能具有促进骨折愈合的作用。
［关键词］ 脑损伤；脊髓损伤；股骨骨折；神经生长因子；大鼠，Wistar
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the expressive change of nerve growth factor (NGF) in bony callus after fracture of the thighbone in rats with cerebral and spinal cord injury. MethodsFortyeight adult healthy female Wistar rats were randomly pided into thighbonefracture group (n=16), thighbonefracturewithcerebralinjury group (n=16) and thighbonefracturewithspinalcordinjury group (n=16). Each group was further pided into postfracture (oneday, fourday, sevenday and 14day) subgroups, with four rats in each subgroup. The animal models were established by free weight dropping and knocking method, expressions of NGF in bony callus were determined by immunohistochemical assay. ResultsThe animal models in simple fracture group appeared a typical healing course, NGF expressed weakly in fibroblast and chondroblasts in callus. In fracture with cerebral injury group, the callus formed slowly and NGF expressed weakly at early stage of fracture, but increased and appeared chondroblasts at 14 days. In fracture with spinal cord injury group, there was a quantity of fibrous callus and cartilaginous callus formation and NGF positive expression at early stage, and bone formation with NGF highest expression at 14 days. ConclusionThe thighbone fracture recovers rapidly and NGF in the callus expresses highly in fracturewith spinalcordinjury group, which suggests that NGF could yield the healing of the fracture.
［KEY WORDS］brain injuries; spinal cord injuries; femoral fractures; nerve growth factors; rats, Wistar
临床上，四肢骨折并发脑和脊髓损伤时，骨折处骨痂过度生长，甚至在肌肉中出现异位骨化，骨折愈合明显快于单纯的四肢骨折。临床和实验研究表明，骨的生长、修复受神经因素的影响，感觉和自主神经纤维分布在骨及骨膜上，其释放的神经肽在骨折愈合重建中发挥重要作用。本实验采用大鼠股骨骨折并发脑或脊髓损伤动物模型，应用免疫组织化学法研究股骨骨折后不同时间点骨痂的变化和骨痂中神经生长因子（NGF）的表达，探讨中枢神经损伤对骨折愈合的影响和机制。
1 材料与方法
1.1 动物分组
成年健康雌性Wistar大鼠48只，8月龄，体质量290~340 g，清洁级，由同济医科大学动物中心提供。随机分为单纯股骨骨折组16只、股骨骨折并脑损伤组16只和股骨骨折并脊髓损伤组16只，每组再分为骨折后1、4、7和14 d等4个观察组，每组4只大鼠。
1.2 动物模型的建立
应用自由坠落重物撞击法建立脑或脊髓损伤动物模型［1］。1期郭静芹，徐进亮，梁爱琴，等脑和脊髓损伤对骨折股骨骨痂中NGF表达影响35
1.2.1 单纯股骨骨折组 将大鼠用100 g/L的水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台上。常规消毒，无菌操作，取股外侧纵行切开1 cm，经股前、外侧肌间隔分离至股骨，用线锯切断股骨中段，然后行克氏针髓腔逆行固定，逐层缝合切口，消毒包扎。术后放置笼中，常规饲养，自由活动与取食。
1.2.2 股骨骨折并脑损伤组 完成上述手术后，在颅顶沿正中线切开皮肤，显露右顶骨，于中线旁2 mm处用骨钻钻开直径5 mm骨窗，暴露硬脑膜。将动物置于重力打击装置下，用质量20 g的金属砝码于30 cm高处，通过玻璃导向管自由坠落，撞击置于硬脑膜上的圆柱形撞击杆，造成中度脑损伤。迅速移开打击装置，逐层缝合切口，消毒包扎。其中有3只大鼠撞击后当场死亡，死亡的大鼠再补齐。术后放置笼中，每8 h挤尿1次，常规饲养，自由活动与取食。
1.2.3 股骨骨折并脊髓损伤组 完成股骨骨折手术后，于动物背部常规消毒，无菌操作，纵行切开皮肤及皮下组织，剥离棘突旁肌肉，切除第7胸椎棘突及椎板，暴露硬脊膜。将动物置于重力打击装置下，用质量20 g的金属砝码于5 cm高处，通过玻璃导向管自由坠落，撞击置于硬脊膜上的圆柱形撞击杆，造成中度脊髓损伤。迅速移开打击装置，逐层缝合切口，消毒包扎。应用改良Tarlov评分法测评大鼠后肢运动功能状况［2］。
1.3 标本采集和切片制备
各组动物在规定的观察时间点分批麻醉后，经左心室依次灌注生理盐水200 mL和40 g/L多聚甲醛300 mL。立即在无菌操作下，沿骨折部位上、下各1 cm处用线锯截取股骨，置于40 g/L多聚甲醛中后固定2 h，蒸馏水浸泡4 h，然后放入质量分数为0.20乙二胺四乙酸二钠中3~4周，充分脱钙（以用针头能轻易扎穿骨皮质为宜）。修剪股骨标本长约1 cm，常规梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿股骨长轴纵行连续切片，片厚7 μm，粘于多聚赖氨酸处理的切片上，置4 ℃冰箱中备用。
1.4 苏木精伊红染色切片染色后，细胞核呈蓝色，细胞浆呈淡红色。
1.5 免疫组织化学染色
兔抗鼠NGF多克隆抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。按照试剂盒说明操作，DAB显色，观察骨痂组织成骨细胞及纤维母细胞内NGF表达情况，细胞浆出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。阴性对照以0.1 mmol/L的PBS代替一抗，不出现阳性着色。
1.6 阳性细胞数和吸光度的检测
每个标本在高倍镜（400倍）下随机观察骨痂处4个不重叠的视野，应用WIDAS21图像分析系统计算每个视野阳性细胞数。
2 结 果
2.1 组织学观察
2.1.1 单纯骨折组 表现为典型的骨折愈合过程，骨痂呈梭形向外膨胀，骨膜反应轻，纤维骨痂量少，膜内成骨和软骨内成骨并存，以前者为主。骨折第4天骨膜开始增厚，骨膜内形成的软骨细胞及纤维母细胞的量逐渐增多。随着时间的延长，成骨细胞增多，骨痂层逐渐增厚，至骨折第14天已形成典型的骨小梁结构。
2.1.2 股骨骨折并脑损伤组 早期表现为血肿和炎性渗出增多，成纤维细胞和软骨细胞较少；骨折第7天成纤维细胞和软骨细胞开始增多；第14天出现成骨细胞及纤维性骨痂形成。
2.1.3 股骨骨折并脊髓损伤组 骨折第1天表现为血肿和炎性渗出反应，骨膜明显增厚；第4天开始骨膜内层形成软骨细胞，成纤维细胞明显增多，形成纤维性骨痂；第7天纤维骨痂中的软骨细胞团增大，有的融合在一起，软骨内骨化少，骨膜下软骨细胞层增厚；第14天仍可见大量纤维骨痂和软骨骨痂，软骨细胞团周边有少量结构稀疏的编织骨形成，外骨膜下的软骨层尚未完全转变成编织骨。
2.2 免疫组织化学观察
单纯股骨骨折组，骨折后骨痂内成纤维细胞及成骨细胞NGF呈阳性表达，阳性细胞数相对较少，骨折第1~14天阳性细胞数无明显变化。骨折并脑损伤组，骨折第1~7天骨痂内成纤维细胞及成骨细胞NGF表达较弱，阳性细胞数很少，第14天表达增强。骨折并脊髓损伤组，骨折第4天骨痂内成纤维细胞及成骨细胞NGF表达增强，第7天阳性细胞数明显增多，第14天达高峰。骨折并脊髓损伤组第4、7、14天，骨折并脑损伤组第14天阳性细胞数与单纯股骨骨折组比较差异有显著性（F=3.24~6.87,q=3.56~7.15,P<0.05）。见表1。
3 讨 论
表1 各组骨痂中NGF阳性细胞数测定结果（略）
NGF是一种含118个氨基酸的多肽激素，是神经生长因子家族的成员。1990年FRENKEL等［3］首次报道了鸡胚的软骨和骨细胞内有NGF，并采用免疫组织化学方法检测了不同时期鸡胚组织的NGF表达情况，发现6~14 d NGF表达阳性，超过17 d表达阴性，认为骨折愈合过程与胚胎骨形成相似，骨痂内和其他未成熟组织可能产生NGF，以诱导神经纤维长入骨痂中。本实验结果表明，脊髓损伤组早期骨痂形成量较单纯骨折组高，7~14 d达高峰，说明脊髓损伤后可使骨痂形成明显增多。免疫组织化学染色显示，脊髓损伤组早期骨膜下大量纤维母细胞和成骨细胞内NGF强阳性表达。据此推测，由于脊髓损伤后早期骨痂内NGF强阳性表达，刺激纤维骨痂和软骨骨痂大量形成，参与骨折愈合过程。脑损伤组早期骨痂形成量少，骨膜下纤维母细胞和成骨细胞内NGF弱阳性表达，其影响因素可能与打击量过大，对脑组织造成过于严重的损伤有关，脑组织的损伤程度和NGF水平之间的关系有待于进一步的研究。中枢神经系统外伤后NGF影响骨折愈合可能机制如下。①NGF与受体结合：由于成骨细胞膜上有NGF的受体［4］，内源性与外源性NGF可与其结合，使成骨细胞发生磷酸化过程，增强骨细胞活性，成骨能力增强，促进骨折愈合。②NGF引导神经长入骨痂：GRILLS等［5］研究证明，骨痂中骨祖细胞、成骨细胞等可产生NGF，NGF可诱导交感和感觉神经纤维长入骨痂，这些神经纤维可释放神经肽递质，有抑制骨吸收作用。它还能通过刺激细胞有丝分裂和骨基质细胞分化刺激骨形成，由于NGF可能通过增加交感神经的支配间接增加血管的生成，从而促进骨化。③NGF促进P物质（SP）、降钙素基因相关肽（CGRP）的释放：MALCANGIO等［6］研究显示，NGF能刺激大鼠脊髓SP、CGRP的释放，其释放的方式可沿轴浆转运到骨折局部，通过旁分泌释放，也可通过血液以内分泌方式到达骨折局部，刺激成骨。④NGF在骨组织对1,25二羟基维生素D3［1,25(OH)2D3］的摄取过程中起调节作用：1,25(OH)2D3在骨代谢过程中非常重要，而在成骨细胞的培养基中加1,25(OH)2D3可使成骨细胞表达NGF［4］，反过来NGF可能调节骨组织对1,25(OH)2D3的摄取。
［参考文献］
［1］郭云良主编. 神经生物学技术［M］. 青岛: 中国海洋大学出版社, 2005:3437.
［2］CHENG H, CCAOY , OLSON L. Spinal cord repair in adult paraplegia rats: partial restoration of hind limb function［J］. Science, 1996, 273 (5274):510.
［3］FRENKEL S R, GUERRA L A, MITCHELL O G, et al. Nerve growth factor in skeletal tissues of the embryonic chick［J］. Cell Tissue Res, 1990,260 (3):507.
［4］JEHAN F, NAVEILHAN P, NEVEU I, et al. Regulation of NGF, BDNF and NGFR gene expression in Rosl7/2.8 cells［J］. Mol Cell Endocrinol, 1996, 116(2):149.
［5］GRILLS B L, SCHUIJERS J A. Immunohistochemical localization of nerve growth factor in fractured and unfractured rat bone［J］. Acta Orthop Scand, 1998, 69(4):415.
［6］MALCANGIO M, GARRETT N E, TOMLINSON D R. Nerve growth factor treatment increases stimulusevoked release of sensory neuropeptides in the rat spinal cord［J］. Eur J Neurosci, 1997, 9(5):1101.