【摘要】 目的 分析半夏种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法 应用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对21份半夏种质资源进行检测。结果 29个引物共得到162条扩增DNA片段,其中123条(75.9%)的片段具多态性,揭示了半夏居群间较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法进行聚类分析表明,所有材料可划分为3类,根据RAPD遗传相似系数划分的类群同地理分布有一定关系。结论 半夏种质资源在分子水平上确实存在较大遗传差异。RAPD标记可作为构建半夏DNA指纹图谱的有效工具。
【关键词】 半夏；随机扩增多态性DNA技术；遗传多样性；DNA指纹图谱
Abstract：Objective To discuss the genetic persity of the germplasm resources of Pinellia ternata on molecular level. Methods The genetic persity of P. ternata 21 different populations were tested by RAPD markers. Results A total of 162 products were amplified by 29 10-mer arbitrary primers, 123 (75.9%) products were found to be polymorphic. The results revealed the abundant genetic persity in P. ternata 21 different populations. The cluster analysis using UPGMA method showed that 21 populations were classified as 3 groups, and the genetic persity in P. ternata based on RAPD GS was correlated with geographic distribution. Conclusion There actually existed much genetic persity on molecular level among the germplasm resources of P. ternata. RAPD markers could be effective tools to construct DNA fingerprintings of P. ternata.
Key words：Pinellia ternata；RAPD；genetic persity；DNA fingerprintings
半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]是天南星科的多年生草本植物。其块茎入药,具有燥湿化痰、降逆止呕、清痞散结的功效[1],为我国的传统中药。由于受环境条件的影响和人们对其需求量的增加,半夏野生资源已近枯竭,同时对不同产地的半夏遗传背景、彼此间的遗传关系尚不清楚。因此,有必要运用分子生物学方面的新技术手段加强其种质资源遗传多样性研究,并开展半夏野生种质资源的保护工作,从而为进一步选育优良种质提供理论指导和依据。
随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphism DNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参[2]、石斛[3]等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 药材
采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。
1.2 DNA的提取
取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3 g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入600 μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5 mL SDS抽提液[100 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；100 mmol/L EDTA(pH 8.0)；0.5 mol/L NaCl；1.5%(W/V) SDS]混匀。将1.2 mL匀浆转移至1.5 mL离心管,室温(>15 ℃)静置10 min。室温下12 000 r/min离心10 min,取上层水相于另一干净1.5 mL离心管,加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)进行抽提,重复抽提2～3次,直到界面清晰为止。取上清液加入到500 μL预冷(4 ℃)无水乙醇中沉淀DNA,此时可见絮状DNA沉淀下来。去上清液,沉淀经70%乙醇洗涤3次,空气中干燥后用TE溶解备用。用紫外分光光度计检测样品DNA浓度,通过计算,稀释到终浓度为50 ng/μL备用。
1.3 RAPD反应
用Sangon公司生产的S系列的100个十聚体随机引物对材料进行扩增筛选,从中共筛选出谱带清晰的引物29个用于试验和统计分析,反应在BIO-RAD 的MyCyclerTM PCR仪上进行。反应总体积25 μL,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Taq酶,0.25 μmol/L引物；100 ng模板DNA,dNTPs各0.2 mmol/L。扩增前94 ℃预变性3 min,每循环在94 ℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72 ℃保温10 min,然后在4 ℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。
1.4 统计学方法
RAPD扩增产物按条带有无分别赋值,有带记为1,无带记为0。利用软件POPGENE处理得到遗传相似系数(Genetic Similarities, GS)[4]。利用GS按不加权成对群算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA)进行聚类。统计分析在NTSYS pc[5]软件系统下进行。 表1 供试的半夏来源（略）
2 结果与讨论
2.1 扩增片段多态性
RAPD扩增结果表明：29个引物中有28个(96.6%)引物的扩增产物具多态性。图1为引物S20的扩增结果。29个引物共得到162条扩增DNA片段,平均每个引物可获得5.6个DNA片段, 其中123条具有多态性,占75.9%。表明半夏种质资源多态性水平较高,充分体现了半夏不同居群间的遗传多样性。
2.2 遗传相似系数
半夏21个不同居群的遗传相似系数值见表2。从中可见,半夏不同居群间的GS分布较广,范围为0.592 6～0.895 1,说明其遗传背景较复杂,表明其遗传多样性相对较丰富。PT0002居群的半夏与PT0009居群的半夏相似系数最大,高达0.895 1,说明它们的亲缘关系最近。另外,PT0002居群的半夏与PT0054居群的半夏相似系数最小,为0.592 6,说明它们的亲缘关系较远。表2 21个半夏居群遗传相似系数值（略）
2.3 供试材料的聚类分析结果
将21个居群材料RAPD的扩增结果,利用POPGENE软件得到的遗传相似性系数数据,再利用NYSYS pc软件进行各品种间UPGMA聚类分析,构建聚类分析图(见图2)。
从聚类图可以看出,在遗传相似系数0.68处,所有材料可以划分成3组,即Ⅰ组：居群PT0001,PT0037,PT0014,PT0026, Ⅲ组：居群PT0030单独成组。其中,Ⅰ组和Ⅱ组又可分为亚组。材料PT0030为陕西省汉中居群,它与其它材料间的亲缘关系较远,故单独成组且在较小的相似性系数处与其它材料聚在一起。可以认为在很大程度上是由于受汉中当地生态环境条件的影响较大,基因型改变较大,因而在聚类图上单独成组。
图2还表明,不同产地的半夏在基因水平上已发生遗传变异,RAPD技术能够从分子水平上刻划种内不同居群的遗传变异,这为半夏的药材道地性研究提供了分子水平的支持依据,为揭示道地药材的生物学本质提供了一些线索。
2.4 RAPD聚类结果与地理分布的关系
根据RAPD遗传相似系数聚成的3类,分析其地理分布情况。可见由21份材料聚成的3大类主要分布在：Ⅰ组主要为四川盆地边缘重庆市东北至西南方向一线,主要地形为盆周山区,类型变化较小,只有理县(PT0054)居群远离此分布区。Ⅱ组主要为四川盆地中部的平原及四周丘陵和低山地区,类型变化较丰富,有陕西临潼(PT0041)居群和梁平(PT0031),居群则稍偏离此分布区,而江苏徐州(PT0047)居群也归在此区。Ⅲ组为汉中居群,单独为一类群,在地理位置上汉中位于秦岭山脉与大巴山脉之间。说明半夏根据RAPD标记划分的类群同地理分布有一定的关系,也说明半夏居群的地理分布支持了其内部基因出现差异的可能性。
利用随机引物对不同物种基因组DNA进行扩增,其多态性表现不同,如野山参为67.6%[2],石斛多态性为91.2%[3]。本研究结果表明半夏种质资源间多态性为75.9%,推测半夏种质资源基因组DNA多态性较高的原因,主要是由于半夏长期生长在不同地理区域,在逐渐适应各自所处环境过程中遗传物质发生了变化,从而形成各具不同遗传特点的类型, 同时也阐明了中国半夏种质资源在分子水平上确实存在遗传差异。总之,不仅半夏不同居群之间具有较丰富的遗传多样性,而且半夏种质资源的各种各样的变异还与地理上的分布呈一定的相关性。由于半夏繁殖主要为无性繁殖,外界环境条件对半夏资源的基因组成和遗传变异影响较大。本研究同时表明,RAPD技术可以作为半夏的品种选育中鉴别和选择亲本的辅助工具,也为半夏类药材的分类鉴定与道地性评价提供了可能的新手段。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.78.
[2] 马小军,孙小全,孙三省,等.野生人参RAPD指纹的研究[J].药学学报,1999,34(4)：312－316.
[3] 张 铭,黄华荣,廖苏梅,等.石斛属RAPD分析及鉴定铁皮石斛的特异性引物设计[J].中国中药杂志,2001,26(7)：442－447.
[4] Nei M. Genetic distance between populations[J].American Naturalist,1972,106：282－292.
[5] Rohlf F J. NTSYSpc Version 2.1：Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System[CP]. Department of Ecology and Evolution, State University of New York,2000.