作者：司春祥 陈伯华 吕振华 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊
【摘要】 目的 观察凋亡相关基因FasL mRNA在椎间盘细胞中表达的分布。方法 收集胎儿及成人病理腰椎间盘髓核标本，PHAP激活单个核细胞诱导FasL表达，提取总RNA，RTPCR制备FasL基因片段。定向克隆入质粒载体pSPT19多克隆位点构建重组质粒，体外转录制备DigFasL cRNA探针。cRNA探针原位杂交进行FasL mRNA表达分布的观察。结果 克隆化FasL序列经DNA测序准确无误，体外转录cRNA探针标记效果满意；胎儿腰椎间盘组织脊索细胞、软骨样细胞中可检测到FasL mRNA的较高杂交信号，成人突出椎间盘细胞中罕见正常细胞，未检出FasL mRNA信号。结论 FasL基因在胎儿期腰椎间盘细胞内表达，细胞凋亡发生早。成年时期，细胞数急剧减少，代谢功能低下，无法检出凋亡基因表达。
【关键词】 基因 FasL RNA 互补 椎间盘 原位杂交
［ABSTRACT］ Objective To observe the distribution of FasL mRNA in intervertebral disc. Methods Nucleus gelatinosus specimens were collected from fetus and pathologic disc. PBMC was treated by PHAP, and total RNA extracted from the actived PBMC. A fragment of FasL gene was reversely transcripted and amplified from total RNA using onestep RTPCR. PCR product was then inserted into the MCS of pSPT19. After verification of DNA sequencing, the recombinant plasmid pSPT19 was linearized to synthesize the digcRNA probe in vitro. The distribution of FasL mRNA was observed on lumbar intervertebral disc specimens using in situ hybridization. Results The inserted FasL cDNA fragment in pSPT19FasL was identified by DNA sequencing. The label efficiency of cRNA probe was satisfied; The FasL mRNA signals were emerged in both notochord cells and chondrocytelike cells in the nucleus of fetal discs. Conclusion The FasL mRNA was detected in the fetal lumbar intervertebral disc cells, and apoptosis occurred early. In adult, the quantity of intervertebral disc cells reduced, the metabolism of them decreased, and the expression of FasL mRNA could not be detected.
［KEY WORDS］ Gene, FasL; RNA, complementary; Intervertebral disc; In situ hybridization
FasL基因是目前已知的最重要的凋亡调控基因之一，属于肿瘤坏死因子家族成员的凋亡促进因子，是Fas的配体。体内外多种因素可以诱发FasL的表达，通过Fas的介导而产生一系列生化反应，最终导致细胞的凋亡。研究证实，椎间盘组织的间盘细胞上有FasL表达，FasL相关的细胞凋亡与腰椎间盘退行性变的发生有关[12]。但其mRNA表达的研究未见报道。本研究通过克隆FasL cDNA片段制备地高辛标记的FasLcRNA探针，利用原位杂交方法对椎间盘中FasL mRNA的分布进行观察。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器设备
PHAP、DEPC购自Sigma公司，APES购自上海生物工程公司。pSPT19质粒载体、大肠杆菌JM109、EasyHyb、分子克隆所用试剂盒、工具酶及所用仪器设备由青岛大学医学院附属医院中心实验室提供。
1.2 标本来源
收集胎龄＞5月的胎儿及手术取出的椎间盘髓核标本10例，置无菌EP管中液氮速冻后-70 ℃保存。10例病人中,男6例,女4例;年龄32～65岁,中位年龄50岁;病程6月～5年，平均1.4年。L4,5者5例，L5S1者4例。
1.3 引物设计
引物依FasL mRNA序列（NM_000639.1）设计，其上游、下游引物分别来自mRNA序列。PCR产物长334 bp。上游引物的5′端修饰PstⅠ酶切序列，下游引物5′端构建EcoRⅠ酶切位点，CTC保护。引物由北京华美公司合成。上游引物:5′CTCCTGCAGGCCCTTCAATTACCCATATCCC3′，下游引物:5′CTCGAATTCGAGTTCTGCCAGCTCCTTCTGT3′。
1.4 人Fas L 基因片段的克隆化
1.4.1 FasL基因的诱导表达及总RNA的制备人全血1 mL，100 g/L的EDTA抗凝;分离单个核细胞，加入50 mmol/L PHAP 37 ℃激活15 min;然后37 ℃孵育1 h，QIAamp RNA blood Mini kit提取总RNA。
1.4.2 cDNA的合成 按照QIAamp RNA Blood Mini kit说明，在反应混合液中加入下列试剂：5×Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 2.0 μL；5×Q液10 μL；上、下游引物各0.6 μmol/L；RTPCR 酶复合物2.0 μL；Rnasin 30 U；总RNA 1 μg（经70 ℃温育5 min）,总体积50 μL。反应条件：50 ℃预变性30 min；然后95 ℃ 15 min, 94 ℃ 1 min,52 ℃1 min,72 ℃ 1 min,共40个循环;最后72 ℃延伸10 min。QIAquick Gel Extraction kit进行胶上PCR产物回收。
1.4.3 PCR产物的克隆 PCR产物和质粒载体pSPT19分别进行EcoRⅠ、PstⅠ双酶切，15 ℃下T4连接酶连接反应16 h。转化感受态大肠杆菌JM109（CaCl2法制备），氨苄青霉素抗菌及PCR快速筛选获阳性重组子。碱裂解法提取质粒，酚氯仿法抽提。
1.4.4 DNA测序 委托北京华美公司测序。
1.5 体外转录制备cRNA探针
EcoRⅠ酶切线性化重组质粒pSPT19，纯化、定量，按试剂盒说明，RNA聚合酶T7体外转录制备DigFasL cRNA探针。
1.6 原位杂交
1.6.1 杂交前处理 载玻片及盖玻片经APES防脱片剂处理。组织块经40 g/L多聚甲醛PBS（pH 7.4）前固定45 min，入300 g/L蔗糖PBS过夜。OCT包埋，冷冻切片，厚度10 μm。40 g/L多聚甲醛PBS （pH 7.4）后固定10 min，PBS洗涤3 min，共2次。37 ℃烤干2 h。密封，-70 ℃贮存。
1.6.2 原位杂交 切片复温， 2 g/L Triton X100PBS液洗15 min后，PBS洗3 min，共2次；10 mg/L蛋白酶37 ℃消化15 min；冰预冷的2 g/L GlycinePBS液洗3 min，3次； 2.5 g/L乙酸酐作用10 min后PBS液洗3 min；EasyHyb中按1 g/L加入cRNA探针制备杂交液，每片加30 μL，加盖玻片。封口膜封闭，置入湿盒，42 ℃下杂交16 h。
1.6.3 杂交后处理 2×SSC 42 ℃洗涤5 min，共4次；0.1×SSC 42 ℃洗涤30 min，共2次；Buffer1液25 ℃振荡洗涤2 min；Buffer2液25 ℃振荡洗涤3 min；抗Dig抗体(1∶1500) 37 ℃作用2 h；Buffer1作用 15 min，共2次；Buffer3 作用3 min。切片加显色液（buffer3+ NBT/BCIP）37 ℃显色2 h。Buffer1分别作用5、2 min终止显色并摄影。
1.7 结果判断
以细胞胞浆出现蓝紫色染色为FasL mRNA阳性信号。
2 结果
2.1 RTPCR产物的鉴定
RTPCR产物于琼脂糖凝胶上电泳显示，在约328 bp处呈现1条与预期产物相对分子质量大小相符的DNA扩增条带。见图1。
图1 RTPCR产物于琼脂糖凝胶电泳结果（略）
M为pGEM7Zf(+)DNA/Hae Ⅲ Marker；F为RTPCR产物。
2.2 DNA测序
双脱氧法测序结果与GenBank（NM_000639.1）中发表的序列相符，证实插入的FasL序列准确无误。见图2。
图2 FasL DNA测序结果（略）
2.3 胎儿及成人椎间盘的观察
胎儿腰椎间盘组织中，髓核部位可见脊索细胞、软骨样细胞分布较为密集，形态正常。髓核近中央部位部分细胞成簇排列，胞浆内出现蓝紫色染色颗粒，表达FasL mRNA 阳性信号。周边近纤维环区细胞密集，弱阳性细胞和阴性细胞混杂。纤维环部位胶原纤维排列整齐，少见细胞。突出髓核可见椎间盘组织呈典型的退行性改变，髓核纤维化显著，胶原纤维排列紊乱，基质出现大量空泡样变，细胞含量稀少，罕见正常细胞，未检出FasL mRNA信号。
3 讨论
3.1 DigFasL cRNA 探针与mRNA的检测
常用的检测mRNA的方法有原位杂交、Northern blot、Dot blot、RTPCR等多种方法。ANGERER等[1]首先应用RNA探针于原位杂交。与cDNA探针相比，cRNA探针有与组织中mRNA杂交效率高、杂交体稳定、假阳性少、杂交前不用高温变性等优点。因此，使用cRNA探针可使实验有更高的严谨性[2]。用地高辛标记的探针具有对人体无害且可长期保存[3]，特异性强的优越性。cRNA探针不仅可应用于切片上的原位杂交，还可应用于Southern印迹杂交法检测特定基因组序列等。
3.2 腰椎间盘退行性变与细胞凋亡
腰椎间盘退变的发病机制是多因素的。非生理性的机械负重是一个中心病因学因素，生物学因素也起了重要的作用。KOHYAMA等[4]证实在突出的椎间盘中细胞凋亡的发生率高于对照组。JEFFREY等[5]应用外部压缩装置研究静态压缩应力对椎间盘的作用，表明凋亡细胞的百分率与压缩应力及负载时间有关。GRUBER等[6]报道，在腰椎间盘中细胞凋亡的发生率高、细胞活性降低并在增龄和退变过程中产生片状产物，围绕在细胞周围形成隔离屏障，可影响单个核细胞的活性和细胞间通讯。
3.3 FasL与腰椎间盘退变
退变腰椎间盘的主要病理改变为因多种原因所致的细胞凋亡，椎间盘细胞数量减少及椎间盘基质的降解。当软骨样细胞死亡增加，其合成细胞外基质的能力下降，不能有效地维持椎间盘基质的胶体渗透压，从而导致椎间盘脱水及退变。Fas/FasL系统参与突出椎间盘组织细胞的凋亡。
TROUT认为在脊柱发育完成后，髓核中的活细胞中仍具有功能[7]。也有人认为椎间盘中细胞随着年龄的增加而出现一定程度的增加，但有活力的细胞数目下降，其中大部分活力低下甚至死亡[8]。细胞死亡有两种基本方式，即坏死和凋亡。研究显示，人类腰椎间盘组织中存在凋亡的软骨样细胞[9]。研究证实，突出椎间盘的间盘细胞上有FasL及Fas表达。Fas/FasL可能诱导退变腰椎间盘组织进行超常的凋亡，从而降低了椎间盘髓核Ⅱ型胶原的产生，促进了退行性变的发生，加速了腰椎间盘突出症的进程[10～13]。这可能是腰椎间盘退变发生及进展的机制之一。
总之，本文研究显示，胎儿腰椎间盘内细胞密集、形态正常，内有FasL mRNA分布。而在腰椎管狭窄取出的椎间盘中细胞数量减少。病理性腰椎间盘中呈现出明显的退行性变，细胞稀少几乎无正常细胞结构可见，FasL mRNA信号未能检出。
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