电镜技术论文
电镜技术论文 电镜技术论文篇一 电镜样品制备技术的应用 【关键词】 电镜样品;制备;咨询 随着科技和 经济 的高速 发展 ，科研、医疗及诊断水平快速提高， 电子 显微镜在 现代 生物医学研究中的应用越来越广泛，研究内容越来越丰富， 针对性越来越强，加之生物样品多样化，对电镜样品制备技术提出了更多更高的 要求。为了避免实验的盲目性，避免因解释不够、实验准备不充分、操作不当引 起的纠纷，减少实验的失败率，务必要抓好电镜样品制备技术。1电镜样品制备的基本要求 首先根据实验的需要，拟定实验计划，制定出实验流程，根据经济承 受能力合理选择实验分组和时相点。其次，正确取材腹腔镜下贲门食管区局部解 剖的临床意义很关键：取材固定要快，必须在固定液中及时修小。固定液由电镜 室提供，不能自己配制(特殊标本除外)。标本保存在4 ℃冰箱，不得冰冻。样品 处理步骤多而复杂，耗时长，所以要预计镜下观察结果的时间，便于安排实验。
2特殊电镜样品的制备方法 针对不同的实验目的，不同的标本取材，寻求不同的电镜样品制备方 法。作者经过长期的实验反复摸索，得到许多有应用价值的新技术、新方法，为 有类似课题研究的科研人员的电镜技术咨询提供理论依据。例如要观察组织细胞 中的钙，只有采用钙离子捕捉法，通过细胞化学间接地来进行钙的定位[1]。为 了促进组织细胞内钙化学充分反应，就如何选择底物、捕捉剂、如何配制试剂和 灌注固定等进行摸索，得到有效的、可行的电镜样品制备方法，可供 参考 。如 果要观察培养细胞间连接，建议采用改进的薄膜细胞培养法，优势在于细胞超微 结构保存良好，能保持细胞间原有的位置关系，利于反复切片，解决了单层培养 细胞顶扣包埋后切片难、成功率低的问题[2]。悬浮细胞培养，悬浮物质作为悬 浮细胞生长载体是近年组织工程研究的新方法，如何观察悬浮细胞生长状态的真 实超微结构图像是电镜制样的新课题。改进的悬浮细胞直接沉降法和悬浮物质直 接移液法，解决了传统的悬浮细胞扫描电镜制样细胞和物质容易丢失、细胞表面特殊微细结构保存不好的问题[3]。电镜免疫技术应用越来越广泛，但制样复杂， 影响因素多，阳性率低。在样品制备技术咨询时，根据实验要求和不同的组织细 胞，不断查阅 文献 ，共同探讨，合理选择标记物、固定液、免疫染色和电子染 色等，使免疫电镜技术不断提高，逐步成熟，为科研快速发展奠定基础。
3利用电镜技术用户资源提供技术咨询 电镜室是为科研人员服务的，是设备和专业技术力量较集中的单位。
为了提高创新能力，扩大交流合作，加强校内外信息沟通，与科研人员共同建立 了电镜技术用户资源共享平台，提供相关的技术咨询服务。建立电镜技术用户资 源库，详细记录了用户名、实验日期、实验目的、标本类型、制样步骤和方法、 实验结果、所在单位和联系电话等，相关科研人员只需采取简单而灵活的电话咨 询或发邮件等方式进行技术经验交流，包括试剂的购买厂家或贵重试剂合用，试 剂的配制，实验流程，标本处理方法，实验操作中的改进措施，实验结果的分析 等。实践证明，实验前通过用户与电镜专业技术人员、用户与用户之间的电镜技 术咨询，相互借鉴，共同探讨，促进了科研人员之间的交流与合作，扩大了宣传。
实验成功的技术方法和理论成果被广泛推广应用，电镜技术不断被刷新，积累了 许多有应用价值的电镜样品制备经验，丰富了形态学研究的内容。
科研的成功在于把关每个环节，对于形态学研究要认真对待电镜样品 制备技术的咨询，明确方向，拟订实验方案，不断创新并解决技术难题，才能使 超微结构研究取得突破性进展，适应 现代 医学的 发展 。
【 参考 文献 】 [1] 陶忠芬，李文刚，等.大鼠膀胱平滑肌过度充盈后钙离子分布的变 化[J]. 第三军医大学学报， 2006，28(6)：608-609. [2] 赵娟，徐淑梅.一种淀粉样蛋白电镜标本制备的新方法[J].天津医 药，2007，35(4)：287-288. [3] 路菊,陶忠芬,等.悬浮状物质的样品制备及扫描电镜观察[J].第三 军医大学学报,2007，29(4)：368-369. 电镜技术论文篇二 浮游病毒的电镜观察摘要：直接用戊二醛固定水样中的浮游病毒，通过超速离心使已固定 的浮游病毒沉淀到覆有Formvar膜和碳支持膜的铜网上，经醋酸双氧铀染色后， 利用透射电镜对湖水中的浮游病毒进行观察，结果可观察到球形、杆状和蝌蚪状 等形态各异的浮游病毒颗粒及球形病毒的囊膜子粒、杆状病毒的核衣壳、具有不 同尾部的蝌蚪状病毒等的精细超微结构，从而建立了一种简便、快捷和高效研究 浮游病毒的电镜方法。
关键词：电镜观察;浮游病毒：超微结构 中图分类号：Q939.48 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)01-0048-04 电镜技术已广泛用于病毒的形态特征、分子结构以及与宿主细胞相互 作用的研究，电镜观察可为病毒的形态、超微结构及分类定位提供最直观的依据， 但要通过电镜对水样中的病毒进行观察，通常必须对水样进行浓缩和病毒分离， 浮游病毒是存在于水体中的病毒，浮游病毒也是指水生态系统中的病 毒，目前被普遍认为是水体微生物群落中丰富且重要的活性成分，它能调节水体 中异养细菌，蓝藻和真核藻类的物种多样性和生物产量，影响生物地化循环，介 导水生态系统中微生物之间的基因转换，对水环境乃至整个生态系统都具有重要 影响，因此受到人们的广泛关注，近些年已有报道指出，浮游病毒存在不同的形 态类群。
从水样中分离浓缩病毒，不仅过程繁杂、耗时长、费用高，还会使水 样中病毒的数量及完整性受损，可否免去分离浓缩程序，直接对水样中的浮游病 毒进行制样和电镜观察呢因此，本文着重对水样中浮游病毒样品的不同制备方法 及电镜观察效果进行比较。
1 材料与方法 1.1 水样的采集 将取样器浸入武汉东湖水面以下10cm处取出水样，装入收集瓶内， 立即加入戊二醛(按体积比水样：戊二醛=9:1，使之终浓度为2.5%)进行固定，并迅速将固定后的水样置于4℃冰箱内保存，备用。
1.2 制样 方法之一：水样直接滴到铜网上，采用常规的滴染法，即把水样直接 滴在覆有Formvar膜和碳支持膜的铜网上，使形成一小液珠，放置片刻，用滤纸 条吸去多余的液体，自然干燥。
方法之：水样经超速离心到铜网上，参照刘艳鸣等的方法(2005)，以 25000r/min离心3h，使病毒沉淀到铜网上，弃去上清，空气干燥， 1.3 染色 醋酸双氧铀染色，在蜡盘中滴加2%的醋酸双氧铀，然后将上述干燥 好的铜网漂浮在染液上，染色2-3min。
磷钨酸染色，将2%的磷钨酸滴加到蜡盘中，将上述干燥好的铜网插 入其中，染色2-3min， 1.4 电镜观察 在JEM-1230型透射电镜下观察，加速电压为100kV，利用GATAN INC CCD图像传输系统，获得电镜图片。
2 结果 2.1 制样方法对观察效果的影响 我们分别采用了两种制样方法和两种染色方法。结果显示：不同的制 样和染色方法对电镜观察效果有明显的影响。
利用方法一所制备的样品，无论经醋酸双氧铀染色，还是磷钨酸染色， 都存在杂质多，背景暗，而病毒颗粒少的情况，甚至许多视野看不到病毒颗粒， 可见，该方法不适宜制备浮游病毒的样品。
利用方法二所制备的样品，经磷钨酸染色后，整个图像背景杂乱，病 毒颗粒分布不均匀，形态模糊，该方法也无法对水样中的浮游病毒进行准确观察。
同样利用方法二所制备的样品，经醋酸双氧铀染色后，可观察到大量形态和数量不同的病毒颗粒，因此该方法可有效用于浮游病毒的形态观察及计数 分析，下述电镜图片均是通过该方法得到的。
2.2 浮游病毒的种类、形态及精细结构 用方法二所制备的浮游病毒样品，在透射电镜下，不仅可清晰地观察 到病毒颗粒的形态，如球形、杆状和蝌蚪状等(图1)，还能了解其部分精细结构， 包括球形病毒的子粒、杆状病毒的核衣壳(横纹状结构)和蝌蚪状病毒的尾髓等. 2.3 浮游病毒的计数分析 在进行样品观察时，可以根据需要来调节电镜的放大倍数，如要了解 病毒的精细结构时，可将放大倍数调节到8-10万倍;如要对水样中的浮游病毒进行 计数分析，就将放大倍数调低至2万倍左右，在此条件下，视野较宽，病毒的形 态及数量都清晰观察到 3 讨论 我们采用了不同的制样和染色方法，对水体中的浮游病毒进行观察， 结果显示，常规的直接滴染法虽然简便快捷，但由于浮游病毒在水体中的含量与 分离或纯化后的样品相比，其量相对较少且分布不均匀，图像背景杂乱、不清晰， 故很难获得满意的电镜图片，其原因可能是浮游病毒和水中的其它浮游生物、细 胞碎片等固体杂质混在一起，吸附到铜网上，对病毒形态的观察和图片拍摄造成 干扰。
采用超离法制样，可得较好的结果，这是由于在离心力的作用下，一 些比病毒颗粒要大的物质首先沉降到铜网上，并形成一个电子密度高且较均匀的 背景，为浮游病毒的观察起托衬作用，值得注意的是，此方法的离心速度较为关 键，实验表明，用25000r/min的转速(Beckman L-90K超速离心机，SW41转头)比 较适宜，这是由于用过大的离心速度，就会使有蝌蚪状病毒的尾巴折断或损伤;
而离心速度过小，则难使体积较小的病毒沉降到铜网上，不能全面真实地反映待 检水体中浮游病毒的形态多样性及含量等情况，另外，每次离心加入待测水量的 多少，要根据水样中浮游生物、其它悬浮颗粒物的含量以及湖水的富营养化程度 等因素来定，在超富营养区的水样中，细菌、藻类等浮游生物及其它悬浮杂质较 多，每次可加入1mL左右的水样;而来自富营养区的水样，每次加入1.5mL左右;
来自中等营养区的水样，则要加入2mL左右，这样才能使离心到铜网上的样品分 布均匀、数量适中，能获得较好的观察效果。用磷钨酸对浮游病毒进行染色，只产生负染效应，由于它与支持膜的 粘附作用很弱，染色后的标本不能久留，因此，常难以观察到浮游病毒的精细结 构，当我们选用醋酸双氧铀溶液作为染色剂时，由于醋酸双氧铀可产生正染和负 染两种效果，在铜网中杂质多、背景暗的区域可观察到浅色的病毒颗粒;在浅色 的背景下则可观察到深色的病毒颗粒，因此，处理得当，就能有效观察到不同背 景条件下的浮游病毒颗粒，同时，醋酸双氧铀容易与支持膜粘附，产生较强的反 差，染色后的标本较稳定，有利于保存。
在建立了适宜浮游病毒制样和染色方法的基础上，获得了不同病毒颗 粒形态的图片、病毒精细结构的图片，这显示所建立的方法，能简便、有效地用 于浮游病毒的研究，包括用于浮游病毒的计数分析。
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