【摘要】 目的 观察金银花提取物体外抑制甲型流感病毒FM1株的作用。方法 采用血凝试验方法,测定不同浓度金银花提取物体外和鸡胚内抑制流感病毒效价,分析金银花提取物对病毒增殖的影响。结果 与病毒对照组比较,金银花提取物组血凝效价降低,其抑制作用时间可从1 h持续到24 h,其对病毒的抑制作用随着药物浓度的降低而逐渐减弱；金银花提取物在100、50、25 mg/mL时,对感染流感病毒鸡胚具有预防和保护治疗作用(P<0.001),而在100 mg/mL时的预防作用明显优于阳性对照病毒唑组(P<0.05)。结论 金银花提取物可有效抑制甲型流感病毒FM1株。
【关键词】 甲型流感病毒；金银花提取物；绿原酸；鸡胚
Abstract：Objective To observe the effect of extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus FM1 strain. Method Use the method of hemagglutination test, determine the hemagglutination inhibition titer that extracts from Flos Lonicerae inhibiting influenza A virus in vitro and in embryonated egg. Result Compared with the control group, the hemagglutination inhibition titer of extracts from Flos Lonicerae group were degraded. The depressant effect kept on from 1 hour to 24 hour, and the depressant effect were degraded with the stepping down of the concentration. At the concentration of 100, 50, 25 mg/mL, extracts from Flos Lonicerae had the preventative effect and therapeutical effect on embryonated egg infected by influenza A virus (P<0.001). At the concentration of 100 mg/mL, the preventative effect of extracts from Flos Lonicerae group was better than Ribavirin group (P<0.05). Conclusion Extracts from Flos Lonicerae can suppress influenza A virus FM1 strain actively.
Key words：influenza A virus；extracts from Flos Lonicerae；Chlorogenic Acid；embryonated egg
本实验对金银花体外抗流感病毒作用进行系列研究,旨在阐明该药在中药复方银翘散中抗流感病毒作用的物质基础,为将该药及其有关复方研制成治疗病毒性呼吸道疾病的现代(复方)中药奠定基础。
1 实验材料
1.1 药物及主要试剂
金银花饮片购于辽宁中医药大学附属医院门诊药局,经辽宁中医药大学中药分析教研室张振秋教授鉴定为忍冬科植物忍冬的花蕾金银花。利巴韦林注射液(江苏吴中实业股份有限公司,批号060208)；绿原酸对照品(自配,浓度0.111 2 mg/mL)。
1.2 病毒
甲型流感病毒鼠肺适应株A/FM1/47(H1N1),中国预防医学科学院病毒研究所提供,冻存于辽宁中医药大学病毒室,经鼠肺、鸡胚传代后为FM1M9E2M1E3M2E4M1E5。
1.3 鸡胚
9日龄尼克白种鸡胚,SPF级,购于辽宁省益康生物制品厂。
1.4 1%鸡红细胞悬液
采集健康公鸡血,阿氏液抗凝,生理盐水1 500 r/min离心洗涤3次,弃上清,以无菌生理盐水配制成1%悬液,4 ℃冷藏备用[1]。
1.5 主要仪器
Ⅱ级生物安全柜(美国Baker公司,型号：SG403TXCE)；高效液相色谱仪(日本岛津SPD-10AVP)；N-2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工作研究所)；低温高速离心机(德国Heraeus,型号：Biofuge 28RS)；台式压力蒸汽灭菌器(沈阳盛达生物电子设备有限公司)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；AS3120电子超声仪。
2 实验方法
2.1 金银花提取物的制备及其鉴定
2.1.1 药物提取
电子天平称量金银花饮片放入圆底烧瓶中,加入配制好的80%乙醇14倍量,电热套加热回流2 h；第1次提取后倾倒滤液,药渣再加80%乙醇10倍量,加热回流1 h；合并滤液,加热浓缩,水浴箱通风橱加热挥发成膏状,置于电热烘箱内烘干,研成粉末避光冷藏备用。用于体外实验时,用生理盐水配成浓度为400 mg/mL的溶液,高速离心机4 000 r/min离心30 min,取上清,高温高压灭菌后4 ℃冷藏备用。
2.1.2 供试品溶液的制备
精称样品粉末0.1751 g,置锥形瓶中,加50%甲醇50 mL定容,超声30 min；放冷,过滤,取续滤液5 mL,入棕色量瓶保存待测,检测时用0.45 μm微孔滤膜过滤。
2.1.3 标准曲线绘制及样品的测定
吸取对照品溶液5 μL注入液相色谱仪,以乙腈-0.4%磷酸(13∶87)为流动相,柱温为35 ℃；流速为1.0 mL/min,于327 nm波长处检测；以绿原酸峰面积为纵坐标,绿原酸量(μg)为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程。并在上述色谱条件下测定对照品溶液及供试品溶液的峰面积。
2.2 流感病毒增毒及其在鸡胚上半数感染量的测定
将病毒原液接种于局部消毒后的9日龄SPF鸡胚尿囊腔,每胚接种0.1 mL,石蜡封口,33～35 ℃温箱孵育48 h,4 ℃过夜。收取尿囊液,红细胞凝集试验测血凝滴度。
将流感病毒原液系列对数稀释(10-1～10-12),分别接种在事先标记好的鸡胚尿囊腔内,每个浓度接种4个鸡胚,并做生理盐水对照。将注射了流感病毒的鸡胚放入33～35 ℃温箱内,48 h后取出,放入4 ℃冰箱内过夜；收取尿囊液,每胚0.1 mL依次加入作好标记的血凝板上,再加入预先配制好1%的鸡血球0.1 mL,轻摇后40 min观察结果,用k·rber公式[2]计算。测得EID50为10-6.28,实验用100EID50。
2.3 金银花提取物最大不凝血浓度的测定
中药中含有植物血凝素,在体外实验中往往引起红细胞凝集,造成假阳性结果。因此,应用血凝试验探讨中药体外抑制病毒作用,必须测定中药的最大不凝血浓度以去除影响因素。处理好的药液从原浓度始,用pH值7.4的Hank,s工作液2倍系列稀释6个浓度：2-1～2-6(400～12.5 mg/mL),分别加入等量固定血凝单位的流感病毒,33～35 ℃温箱中和2 h,测定血凝效价,同时设Hank,s液对照和病毒对照。结果测得金银花提取物不引起血凝的最大浓度为25 mg/mL。
2.4 金银花提取物及利巴韦林注射液对鸡胚最大无毒浓度的测定
用含PS 10%的生理盐水将药物原液作连续2倍系列稀释至1∶512浓度,每次抽取0.2 mL分别接种在预先作好标记的鸡胚上,每个浓度接种4个鸡胚,并设生理盐水对照。将接种好的鸡胚放入35 ℃温箱内孵育48 h,每12 h观察记录鸡胚存活情况,24 h内死亡的鸡胚不记入药物毒性作用致死数。金银花提取物的最大无毒浓度为100 mg/mL,利巴韦林注射液最大无毒浓度为50 mg/mL。
2.5 金银花提取物不同浓度、不同时间体外抑制病毒作用
用pH 为7.4的Hank,s工作液,将金银花提取物溶液从最大不凝血浓度起作系列2倍稀释3个浓度,每个浓度4支试管,分别加入等量100EID50的流感病毒,置33～35 ℃温箱中和1、4、8、14、16、24 h,测各组药物不同浓度、不同时间点血凝效价,同时设病毒对照和Hank,s液对照。
2.6 金银花提取物对甲型流感病毒感染鸡胚预防和保护作用
2.6.1 预防作用
药物原液自TD0开始2倍比稀释3个浓度(100、50、25 mg/mL),每胚0.1 mL分别接种鸡胚,每个浓度8个鸡胚,37 ℃孵育2 h,并设生理盐水和病毒对照；然后分别接种0.1 mL的100EID50的病毒悬液,放入35 ℃温箱内48 h,再4 ℃过夜。抽取尿囊液,测定血凝滴度。
2.6.2 治疗作用
用100EID50病毒悬液接种鸡胚,34 ℃孵育2 h,再分别接种与预防实验同浓度的药液,每组8个鸡胚,并设生理盐水及病毒对照。34 ℃温箱内48 h,再4 ℃过夜。抽取尿囊液,测定血凝滴度。
3 结果
(见图1,表1～表3)表1 金银花提取物体外直接抑制流感病毒作用(略)表2 不同浓度金银花提取物对流感病毒感染鸡胚预防作用(略)注：与病毒对照组比较,**P<0.001；与病毒唑组比较,#P<0.05（下同）。表3 不同浓度金银花提取物对流感病毒感染鸡胚治疗作用(略)
在供试样品溶液色谱图中,与对照品溶液色谱图相应的位置上,有一相同保留时间的色谱峰,经计算金银花提取物样品中绿原酸含量为1.76%。
4 讨论
我们的前期实验得出银翘散全方、君药组和臣药组均具有抑制流感病毒在小鼠体内增殖、保护肺组织的作用。单味药金银花提取物抗甲型流感病毒FM1株的体外实验结果表明,该药具有很强的直接杀灭甲型流感病毒FM1株的作用,并且对流感病毒的预防及治疗作用效果显著。
绿原酸是金银花的主要药用成分,具有显著的清热解毒和抗菌消炎作用,国家药典也以绿原酸为指标控制含量。本实验采用80%乙醇回流提取方法,去除部分杂质,得到金银花粗提物,并通过样品含量计算,得到金银花抗流感病毒有效部位中绿原酸含量为1.76%,达到药典标准。因此可以推论,绿原酸可能是中药金银花抗流感病毒作用的主要物质基础之一。
【参考文献】
[1] 马丙祥,段晓颖,王志超,等.双花喷雾剂治疗小儿上呼吸道感染临床与实验研究[J].中国中西医结合杂志,2000,20(9)：655.
[2] 郭元吉.流行性感冒病毒及实验技术[M].北京：中国三峡出版社, 1997.120.