黑曲霉发酵对麦麸多酚及其抗氧化活性的影响5300字
黑曲霉发酵对麦麸多酚及其抗氧化活性的影响5300字 小麦是我国最重要的粮食作物，主要用于制粉。麦麸是小麦制粉过程中主要 的副产品，占小麦加工量的20%左右。目前，我国麦麸的年产量可达3 000万吨以 上，但由于其适口性差，尚未得到很好的利用，主要用于饲料。麦麸中含有丰富 的蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素、酶类和酚类化合物。麦麸含有 的酚类主要为酚酸，类黄酮和木酚素3种。麦麸中的酚酸化合物主要为阿魏酸， 含量为0.4%～1%[1-2]。阿魏酸是绝大多数植物体内都存在的一种酚酸，化学名 称是4-羟基-3-甲氧基肉桂酸[3]，研究表明：阿魏酸具有抗氧化、抗血栓、降血 脂、防治冠心病、抗菌、抗病毒、抗突变、防癌、免疫调节等功能活性[4-5]。目前，阿魏酸是国际公认的天然抗氧化剂，被用于、保健品、化妆品、食品添加 剂等行业。阿魏酸的提取主要是以当归、川穹等一些中草药为原料，成本较高。
以麦麸为原料制备阿魏酸，由于麦麸来源广泛、价格低廉，若从麦麸中提取阿魏 酸，将会降低成本，提高麦麸的深加工和再利用程度，增加麦麸的经济价值。
1 材料与方法 1.1 材料 麦麸（购于商州区农贸市场）,马铃薯（超市购买）,黑曲霉（2169）（从中 国工业微生物菌种保藏管理中心购买的菌粉）。
1.2 方法 1.2.1 麦麸处理 麦麸干燥、粉碎过40目筛后备用。
1.2.2 培养基配制 马铃薯液体培养基：200 g马铃薯,洗净去皮然后切成小块,加水1 000 mL， 煮沸30 mim后用纱布过滤,再加20 g葡萄糖,充分溶解后定容到1 000 mL，121 ℃ 灭菌30 min。
马铃薯固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的琼脂，加热至100 ℃溶解， 40 ℃下冷却并凝固，成为固体培养基。
1.2.3 孢子悬液的制备将黑曲霉菌粉转移至液体马铃薯培养基中活化1 d，然后蘸取菌液接种到马 铃薯斜面培养基上培养三代，第三代产生的孢子用无菌水从斜面洗下孢子，调整 孢子数为1×107 CFU·mL-1[6]。
1.2.4 黑曲霉培养 [7-8],设计黑曲霉在麦麸中的培养时间分别为1、3、5、7 d。分别称取10 g 麦麸于已标记好的三角瓶中，加入60%的蒸馏水，121 ℃灭菌20 min。其中，每 瓶接种量为1 mL孢子悬液，不加孢子悬液的作为对照，三个重复。
1.2.5 麦麸多酚的提取与浓缩 对麦麸的提取浓缩参照文献[9-11]，发酵好的麦麸用100 mL 80%乙醇50 ℃ 浸提30 min，提取3次，浸提液4 000 rpm离心10 min，然后收集上清液用旋转蒸 发仪蒸干，用5 mL甲醇溶解，保存，备用。
1.2.6 总酚含量测定 称取10 mg阿魏酸标品，溶于80%甲醇溶液并在50 mL容量瓶中定容至50 mL， 配成0.2 mg·mL－1的标准阿魏酸溶液。分别取上述溶液1、2、3、4、5 mL于10 mL 的容量瓶中，用80%甲醇溶液定容至10 mL，得到20、40、60、80、100 μg·mL －1的阿魏酸标准溶液，各取该溶液0.5 mL于带塞的试管中，分别加入2.5 mL蒸 馏水，混匀，再加入福林酚试剂0.5 mL，混匀，然后加入质量浓度为7.5%的碳酸 钠溶液1.5 mL，混合均匀，室温下避光保存30 min后于760 nm波长处测定吸光度， 以不加孢子悬液作为空白对照，结果以麦麸中含有相当阿魏酸的毫克数表示，单 位为μg·g－1。以吸光度为纵坐标，阿魏酸含量为横坐标绘制标准曲线[12]。
结果见图1所示。线性方程为y=0.008 6x+0.013 6，R2=0.999 2，表明阿魏 酸在试验浓度范围内呈现良好的线型。
1.2.7 阿魏酸的高效液相色谱分析 麦麸中含多种酚酸化合物，其中，含量最高的是阿魏酸。但在麦麸中，阿魏 酸主要以结合形式存在，阿魏酸的测定采用高效液相色谱法，色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，0.5 mm），波长 280 nm，流动相：A液为0.1%甲酸水溶液（0.1% 的甲酸，5%的乙腈和94.9%的水混合制得）；
B液为100%乙腈，线性梯度洗脱，流速为1.0 mL·min－1，进样量 20 μL。梯度洗脱程序：0～7 min（95%A 液，5%B 液），7～12 min（78%A液，22%B液），12～20 min（81%A液，19%B液），20～ 22 min（95%A 液，5% B液）。阿魏酸标品，溶于80%甲醇溶液，配成100 μg·mL －1的标准阿魏酸溶液，样品稀释10倍，用0.45 μm有机微滤膜过滤。根据出峰 时间定性，峰面积定量。阿魏酸在HPLC中的色谱图如图2。
分别以阿魏酸的标准浓度作为自变量，对应的峰面积作为因变量，对测定结 果进行线性回归绘制标准曲线，结果见图3所示。线性方程为y=771 63x-166 108， R2=0.998 6，表明阿魏酸在试验浓度范围内呈现良好的线型。
1.2.8 抗氧化活性的测定 1）清除DPPH自由基能力的测定 准确移取适当稀释的样品溶液0.2 mL于带塞的试管中，加入0.1 mmol·L－1 的DPPH（80%甲醇溶解）溶液3.8 mL，混匀，常温避光反应30 min后于517 nm波 长处测定吸光度值。以80%甲醇溶液代替样品作为对照，以80%甲醇溶液调零，DPPH 自由基的清除能力以其清除率表示。各个样品的酚类化合物的DPPH自由基的清除 能力的计算公式为[13]：
DPPH自由基清除率（%）=（1-A1/A0）×100% 式中：A1为样品组的吸光度；
A0为对照组的吸光度。
2）总还原能力的测定 [14]，并加以修改。准确移取1 mL适当稀释的样品溶液于带塞的试管中，加 入1 mL 0.2 mol·L－1的磷酸缓冲溶液（pH为6.6），再加入1%的铁氰化钾 （K2Fe(CN)6）溶液1 mL，混合均匀，在50 ℃水浴锅中水浴20 min，然后急速冷 却，再加入10%的三氯乙酸溶液1 mL，混合均匀后3 000 rpm离心10 min。移取上 清液2.0 mL，加入2.0 mL蒸馏水后再加入0.4 mL 0.1%的三氯化铁溶液，混合均 匀，室温下反应10 min，在700 nm波长处测定其吸光度值。
2 结果与分析 2.1 黑曲霉培养时间对麦麸总酚含量的影响 麦麸接种黑曲霉培养1～7 d，在不同的培养时间内，测定麦麸中总酚含量，结果如图4所示。
由图4可见，麦麸在黑曲霉的作用下，总酚的含量先增加，第3 d时达最高， 为不加孢子悬液空白对照的2.4倍左右。随后含量降低，这可能是由于黑曲霉发 酵麦麸产生的酶可降解麦麸中结合态多酚的链接键，使麦麸中可提取总酚的含量 增加。但随后，黑曲霉又以酚酸为其呼吸的碳源，从而总酚含量下降[4]。
2.2 黑曲霉培养过程中阿魏酸含量的变化 培养过程中阿魏酸含量的变化如图5所示。黑曲霉接种培养3 d后，麦麸多酚 的色谱图如图6所示。
由图5可见，麦麸在黑曲霉作用下，阿魏酸的含量都有一定程度的变化。且 其变化趋势类似于总酚变化。即麦麸中接种黑曲霉后，阿魏酸的含量先增加后降 低，主要原因是，黑曲霉发酵麦麸可产生阿魏酸酯酶，阿魏酸酯酶降解麦麸，释 放阿魏酸，使麦麸中阿魏酸的含量增加，但随后，黑曲霉又以阿魏酸为其呼吸的 碳源，从而导致阿魏酸含量下降。发酵第3 d时，麦麸中阿魏酸的含量由发酵第1 d的65.914 μg·g－1增加到260.869 μg·g－1，增加了3.9倍。
2.3 黑曲霉培养对麦麸抗氧化活性的影响 2.3.1 黑曲霉培养对麦麸DPPH自由基清除能力的影响 麦麸接种黑曲霉，培养1～7 d，在不同的培养时间内，测定麦麸乙醇提取物 对DPPH自由基清除能力，结果如图7所示。
由图7可见，黑曲霉培养时间不同，麦麸乙醇提取物对DPPH自由基的清除率 变化趋势是先增加后减小，同麦麸中总酚含量的变化趋势基本一致。培养3 d时， 麦麸对DPPH自由基的清除率达最大值，说明结合态阿魏酸对DPPH自由基无清除能 力，黑曲霉发酵麦麸产生阿魏酸酯酶，阿魏酸酯酶降解麦麸，释放阿魏酸，使麦 麸对DPPH自由基的清除率增大。
2.3.2 黑曲霉培养对麦麸总还原力的影响 总还原能力的测定是抗氧化剂将三价铁还原为二价铁的能力，通过测定反应 体系中二价铁的含量来评价抗氧化剂抗氧化能力的大小。黑曲霉培养对麦麸总还 原力的影响如图8所示。吸光度值越大，表明其总还原力越强。由图8可见，不同的培养时间，麦麸的总还原能力的变化趋势与总酚含量的 变化、DPPH自由基的清除能力的变化基本一致。即黑曲霉培养对麦麸的总还原能 力呈先增后降的趋势，培养3 d，麦麸的总还原力最强，进一步也说明游离态阿 魏酸对麦麸还原能力起主要作用。
3 结论与讨论 本研究充分利用丰富廉价的麦麸生产阿魏酸工艺可行，黑曲霉发酵能使麦麸 中可提取总酚、阿魏酸含量增加，但由于黑曲霉又可以作为阿魏酸其呼吸碳源， 从而导致阿魏酸含量最终下降，因此黑曲霉培养时间是提取麦麸中总酚、阿魏酸 的关键因素。若能从黑曲霉培养物中提取酶系，则阿魏酸的提取会更加经济。欧 仕益等[15]研究也认为采用黑曲霉直接发酵麦麸生产阿魏酸不经济，但可以利用 黑曲霉产生的混合酶作用于麦麸生产阿魏酸。本研究发现黑曲霉发酵麦麸产生的 酶系可降解麦麸中结合态多酚及阿魏酸的链接键，使麦麸中可提取总酚及阿魏酸 含量增加，麦麸抗氧化活性增强。
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