【关键词】 人乳腺癌ZR 【摘要】目的：观察PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因）对人乳腺癌细胞ZR751细胞增殖和细胞周期的影响。方法：利用脂质体介导法将携带有野生型和突变型PTEN cDNA的真核表达载体pBPwtPTEN和pBPG129RPTEN导入人乳腺癌ZR751细胞（质粒转染成功后实验分为CWTPTEN组、CG129RPTEN组和未转染质粒组即对照组）后，以RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达，并采用MTT法和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期。 结果：CWTPTEN组、CG129RPTEN组细胞PTEN mRNA 及PTEN蛋白出现明显的高表达。CWTPTEN组细胞生长的抑制率可高达42.7%，与对照组比较，差异有显著性(P<0.05)。但CG129RPTEN组细胞生长的抑制率与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)。流式细胞术显示CWTPTEN组细胞周期从G1期到S期已发生抑制。结论：野生型PTEN可依赖其磷酸酶活性抑制肿瘤细胞的增殖，并最终诱导细胞凋亡。
【关键词】 人乳腺癌ZR751细胞； PTEN基因；细胞周期
【Abstract】 Objective: To investigate the effect of the PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten) gene on cell cycle and proliferation in human breast cancer cell line ZR751. Methods: The eukaryotic expression vector pBPwtPTEN and pBPG129RPTEN containing PTEN cDNA was transfected into ZR751 cells by lipofectamine. Three groups were set: CWTPTEN, CG129RPTEN and cells without transfection as the control group. Reverse transcriptionpolymerase chain reaction and Westernblot methods were used to detect PTEN expression in the transfected ZR751 cells. The cell cycle, cell proliferation and cell apoptosis of the ZR751 cells was determined by the MTT and flow cytometry. Results: High expression of PTEN mRNA and protein was seen in the transfected ZR751 cells. The proliferation of CWTPTEN cells were inhibited by 42.7% (vs the control group, P< 0.05), while CG129RPTEN cells showed no significant change in proliferation (vs the control group, P> 0.05). The cell cycle from G1 to S of CWTPTEN cells was inhibited. Conclusion: Wide type PTEN gene might suppress the growth and induces the apoptosis in human breast cancer cell line ZR751 cells through its phosphatase activity.
【Key words】 ZR751; PTEN; cell cycle; proliferation
PTEN（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因）是继p53基因之后新近发现的与各种肿瘤密切相关的一个抑癌基因，其突变与缺失见于多种恶性肿瘤，如前列腺癌、胶质瘤、乳腺癌等。目前发现PTEN是唯一一个编码具有双重磷酸酶活性的抑癌基因［1］，因其凭借磷酸酶活性负调控PI3K/Akt信号传导途径而备受关注。虽有研究表明，PTEN的缺失与突变与乳腺癌的发生发展密切相关［2］，然而目前有关PTEN基因对乳腺癌细胞生长抑制的作用多集中在对乳腺癌组织的研究，而PTEN基因转染对人乳腺癌细胞的研究不多。本实验以外源性PTEN基因导入该基因内源性缺失的乳腺癌细胞ZR751中，通过RTPCR、Western blot 分析目的基因的表达；同时采用MTT法和流式细胞术检测转染后PTEN基因对ZR751细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响，以探讨其在乳腺癌细胞株生长抑制过程中的作用机制。
1 材料与方法
1．1 材料
人乳腺癌细胞株ZR751由中国医学科学院基础医学研究所提供。pBPwtPTEN及pBPG129RPTEN质粒由美国加州大学Ludwig癌症研究所Furnari教授惠赠。胰蛋白酶为美国Gibco公司产品，胎牛血清为杭州四季青微生物材料工程公司产品。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，嘌呤霉素、DNA Ladder 、DEPC、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等购自美国Sigma公司。RTPCR反应试剂盒购自QIAGEN公司。小鼠抗人PTEN单克隆抗体、山羊抗人Actin多克隆抗体、EXL发光试剂盒购自Santa Cruz 生物技术公司。HRP标记山羊抗小鼠IgG、 HRP标记马抗山羊IgG等其它试剂购自北京中山生物技术有限公司等国内公司。PTEN、GAPDH引物由上海生工公司合成。
1．2 方法
1.2.1 细胞培养 ZR751细胞培养于含体积分数为15%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的RPMI1640完全培养液中，同时细胞培养液加入0.5 U/mL胰岛素，并将细胞于37 ℃、体积分数为5%CO2饱和湿度孵箱中培养，经过消化传代，取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.2 质粒转染 按照Lipofectamine 2000说明书分别将编码人野生型PTEN的真核表达质粒pBP wtPTEN和突变型PTEN质粒pBPG129RPTEN转染对数生长期的ZR751细胞，以1.5 mg/L嘌呤霉素持续筛选3周，挑选阳性细胞克隆，扩增培养。分别将成功转染pBP wtPTEN和pBPG129RPTEN质粒的ZR751细胞命名为CWTPTEN细胞和CG129RPTEN细胞，称为CWTPTEN组和CG129RPTEN组。未转染的ZR751细胞作阴性对照称为对照组。
1.2.3 RTPCR法检测转染前后PTEN基因的表达 用质量分数为0.25%胰蛋白酶消化，收集培养CWTPTEN、CG129RPTEN和ZR751细胞。制成悬浮液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（3.0×106），用Trizol等试剂分别提取CWTPTEN细胞、CG129RPTEN细胞和ZR751细胞中的总RNA，总RNA沉淀溶解于DEPC处理过的无RNase的三蒸水中。采用RTPCR反应试剂盒鉴定各转染细胞PTEN mRNA的表达，利用引物合成软件Premier 5和oligo 6自我设计PTEN（373bp）引物序列为：PTEN/ sense primer: 5’ aaa gct gga aag gga cga ac 3’；PTEN/antisense primer: 5’ cag gta acg gct gag gga ac 3’ ； GAPDH/sense primer: 5’ gaa ggt gaa ggt cgg agt c 3’；GAPDH/antisense primer: 5’ gaa gat ggt gat ggg att tc 3’ 。RTPCR反应体系：50 ℃ 30 min(RT反应)，95 ℃ 15min（预变性），94 ℃ 45sec（变性），55 ℃ 1min（退火），72 ℃ 1min（延伸），共30个循环，72 ℃ 10min（后延伸）；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后观察结果，图像分析软件BandScan 4.3进行光密度积分值分析，计算出PTEN mRNA与内参照GAPDH mRNA的光密度积分值比作为PTEN mRNA的相对含量值。
1.2.4 Westernblot检测PTEN蛋白的表达 用0.25%胰蛋白酶消化，收集培养CWTPTEN细胞、CG129RPTEN细胞和ZR751细胞。制成悬浮液并计算细胞数，每个样本收集等量细胞（5.0×106），加入细胞裂解液，提取蛋白质，以质量分数10%聚聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白电泳转移到硝酸纤维膜（PVDF）上，硝酸纤维膜上加入质量分数10%脱脂奶粉封闭后，加入一抗工作液（小鼠抗人PTEN单克隆抗体，工作浓度为1∶300），4 ℃过夜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶4 000），ECL发光试剂进行显像后拍照，图像经扫描仪扫描后，用Scion Image图像分析软件进行光密度积分值(Integral of optical density，IOD)分析，计算出各目的蛋白表达量与内参照GAPDH 蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。每个图像均重复分析3次，取平均值。
1.2.5 MTT法检测不同PTEN表达质粒对细胞的增殖况 分别取CWTPTEN细胞、CG129RPTEN细胞和ZR751细胞在含15%FCS的RPMI1640培养中培养48h后，加入10 mg/mL MTT 10μL，继续培养4h，在加入100μL /孔的DMSO，取出后，用酶标仪测定吸光度A570 nm，结果取3个平行孔的均值，重复3次实验。肿瘤细胞的存活率（%）=（各组A570 nm/阴性对照组A570 nm）×100%。细胞抑制率（%）=1（各组A570 nm/阴性对照组A570 nm）×100%。
1.2.6 流式细胞术 分别取CWTPTEN细胞、CG129RPTEN细胞和ZR751细胞经0.25%胰蛋白酶消化，冷磷酸缓冲液（PBS）洗涤后离心，用体积分数为70%的4 ℃预冷乙醇固定过夜后，离心收集细胞，用PBS洗3次去除乙醇，细胞团重悬于PBS中，用20μg/mL含RNase A的碘化丙啶（PI）染色液避光染色30 min，经100目尼龙网过滤后进行FCM（flow cytometry， 流式细胞术）检测。
1.2.7 统计学处理 实验计量资料用±s表示，使用SAS 8.0统计软件进行统计描述。行单因素方差分析和q检验，两组抑制率比较行t检验。
2 结果
2.1 PTEN基因成功转染
采用脂质体介导法，将质粒pBPwtPTEN和pBPG129RPTEN转染入ZR751人乳腺癌细胞中，经嘌呤霉素持续筛选，获得阳性转染的细胞克隆。
2.2 RTPCR检测PTEN mRNA 的表达水平
紫外灯下可见，CWTPTEN细胞和CG129RPTEN细胞373bp 处有清晰明亮的条带，而ZR751细胞373bp处条带模糊，3组细胞泳道在226bp 处均出现明亮的条带(见图1)。说明ZR751细胞PTEN mRNA 只有少量表达，而CWTPTEN组和CG129RPTEN组细胞中PTEN mRNA出现高表达。
M：100 bp DNA marker; A: ZR751细胞；B：CG129RPTEN细胞；C：CWTPTEN细胞
图1 转染PTEN前后PTEN mRNA 的表达
2.3 Western bolt检测PTEN 蛋白的表达水平
由图2可见， CWTPTEN细胞和CG129RPTEN细胞具有明显的PTEN蛋白条带，而ZR751细胞PTEN蛋白条带不明显，结果说明，ZR751细胞PTEN蛋白表达水平非常低，而转染后PTEN蛋白水平出现高表达。 A: ZR751细胞；B：CG129RPTEN细胞；C：CWTPTEN细胞
图2 转染PTEN前后PTEN蛋白的表达
2.4 不同表达质粒抑制肿瘤细胞增殖情况
CWTPTEN组与对照组比较，细胞增殖明显受到抑制（抑制率为42.7%，(P<0.05)）；而CG129RPTEN组细胞增殖与对照组比较差异无显著性（P>0.05），见表1。表1 突变型与野生型PTEN质粒对ZR751细胞增殖的影响 2.5 外源性PTEN对ZR751细胞生长周期的影响
流式细胞仪检测细胞周期显示, CWTPTEN组与对照组比较，G1期细胞数由54.52%增加到63.17%，S期细胞数由36.51%变为31.15%，提示从G1期到S期发生抑制。而CG129RPTEN组与对照组比较，差异无显著性（P>0.05），见表2。表2 外源性PTEN对ZR751细胞周期的影响
3 讨论
癌基因的激活和抑癌基因的失活，是目前较为公认的肿瘤发生发展的重要机制［3］。已有研究发现多种抑癌基因（如p53、p16、p21等）在脑胶质瘤等肿瘤中存在有缺失、突变或异常低表达等改变，且表达量随肿瘤恶性程度的增高而降低［4］。PTEN基因自发现并克隆以来作为一种与肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移等生物学特性密切相关的抑癌基因已成为当前研究的热点。PTEN编码403个氨基酸残基构成的蛋白质［5］，其氨基端（1~185）是活性中心，含有一个双重底物特异磷酸酶的结构域，即具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶的活性。前者可使酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸的残基脱磷酸化，在多种途径和细胞周期中发挥作用。PTEN蛋白还可凭借其脂质磷酸酶活性，特异地使磷脂酰肌醇三磷酸（PtdIns(3,4,5)P3）的3’磷酸脱去［6］，使PtdIns(3,4,5)P3转变为PtdIns(4,5)P2，调节第二信使PtdIns(3,4,5)P3的水平，抑制PI3K/Akt信号转导途径，导致细胞信号转导和细胞生长周期的阻滞，进而调控细胞的生长，并最终诱导细胞凋亡［7］。
本实验所用的野生型PTEN表达质粒pBPwtPTEN和磷酸酶活性缺失型PTEN表达质粒pBPG129RPTEN都是将全长为1212bp的人PTEN基因的cDNA连接到pBP载体上构建而成，两者的区别在于，pBPwtPTEN质粒中连接的是具有磷酸酶活性的野生型PTEN基因，而pBPG129RPTEN质粒中的PTEN基因是突变型基因，此基因因其磷酸酶活性的C124位点发生点突变而致其失去脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性。Western blot检测结果表明，转染pBPwtPTEN质粒和转染pBPG129RPTEN质粒组的细胞均出现有PTEN产物蛋白的高表达，其表达水平与对照组相比，差异有显著性（P<0.05）,说明两种PTEN质粒转染到人乳腺癌细胞ZR751均能提高PTEN 蛋白的表达水平。RTPCR结果进一步证实了两种表达质粒转染人乳腺癌细胞ZR751后，能有效地提高PTEN mRNA的表达，进而促进PTEN蛋白的高表达。此外，在细胞增殖方面，本文结果显示：CWTPTEN组与CG129RPTEN组、对照组比较，差异均有显著性；另外，我们还对质粒空载细胞增殖作过观察，其结果与ZR751组比较差异无显著性［8］。从而排除了载体对细胞的毒副作用，表明转染野生型PTEN基因是抑制肿瘤细胞生长的主要原因。流式细胞术的结果表明，PTEN转染组细胞增殖停滞于G1期，并且细胞凋亡明显增加。说明PTEN促进肿瘤细胞凋亡是其抑癌机制之一。
我们在采用野生型PTEN基因转染的同时，以突变型PTEN基因作对照，后者的突变位于磷酸酶活性中心并使其失去磷酸酶活性。结果显示，野生型PTEN基因转染具有抑制肿瘤细胞生长、促进细胞凋亡及引起细胞周期发生阻滞的作用。而突变型PTEN基因转染则没有这样的作用，说明PTEN基因磷酸酶活性的缺陷可能是引起功能差异的主要原因，故认为PTEN的抑癌作用与磷酸酶活性有关。
以上结果显示，PTEN基因可能通过PI3K/Akt途径使ZR751乳腺癌细胞发生细胞周期的改变、抑制其体外增殖。这似乎为乳腺癌的基因治疗提供了新的思路。
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