克隆框架【正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆】

【摘要】 目的 获得骨形态发生蛋白（BMP9）基因并进行基因读码框架的克隆。方法 自正常成人肝组织提取总RNA，一步法RTPCR扩增BMP9，扩增产物经过胶回收及酶切后，克隆入高效真核表达质粒pcDNA4/HisMax，构建重组表达载体。结果 RTPCR扩增获得约1.3 kb大小的产物，经限制性酶切分析和DNA测序，证实为人BMP9基因的完整开放读码框架。重组载体表达读码序列正确。结论 正常成人肝组织总RNA经一步法RTPCR，能够对BMP9基因的开放读码框架进行完整有效的筛选。BMP9开放读码框架的完整克隆为其在骨、内分泌和神经系统等多能作用的转基因实验研究提供了基础。

【关键词】 骨形态发生蛋白质类 重组真核表达载体 逆转录聚合酶链反应

［ABSTRACT］ObjectiveTo clone BMP9 gene in adult liver tissue and construct recombinant eukaryotic expression vectors.MethodsTotal RNA was extracted from normal liver tissue of an adult, then open reading frame of BMP9 was cloned by onestep RTPCR. The PCR products (1.4 kb) were inserted into eukaryotic expression vector, pcDNA4/HisMax, to construct recombinant vector.ResultsAccording to restrictive analysis and DNA sequencing of recombinant vector, the open reading frame of BMP9 was identified and the insert in MCS was correct.ConclusionThe ORF of BMP9 gene can be screened effectively from total RNA of normal liver tissue by onestep RTPCR. The complete clone of ORF of BMP9 has provided the basis for multifunction gene transfer experiments in the fields of orthopedics, endocrinology and central nervous system.

［KEY WORDS］bone morphogenetic proteins; recombinant eukaryotic expression vector; reverse transcriptase polymerase chain reaction

转化生长因子β(TGFβ)超家族在细胞生长和分化中具有重要作用。TGFβ超家族中的一个特殊亚族由骨形态发生蛋白(BMPs)组成。这些二聚体蛋白的特性是在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力[1]。目前在BMP亚家族中已发现40个以上成员，不同的BMP分子通过Ⅰ、Ⅱ型受体在哺乳类动物体内的不同系统发挥生理作用[2]。BMP9是BMPs亚家族的成员之一，人BMP9基因位于染色体10q11.23，其成熟肽段包括110个氨基酸。除具有成骨活性之外，BMP9还具有参与肝的糖代谢、影响神经系统胆碱合成和对造血干细胞双向调节的作用等。本研究利用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）技术筛选BMP9的全长读码框架，克隆入真核表达载体构建重组体，获得准确且高纯度的质粒载体，为BMP9转基因实验研究提供基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集正常成人外伤性肝破裂修复术中切除的破裂肝组织，DEPCPBS反复洗涤后备用。

1.2 总RNA提取

将肝组织反复剪碎后，使用QIAGEN公司生产的QIAamp RNA Blood Mini Kit 试剂盒，按操作手册步骤进行肝组织总RNA的提取。

1.3 Onestep RTPCR扩增及PCR产物胶上回收

根据人BMP9在GenBank中的序列设计能扩增BMP9完整开放读码框架的引物，并分别在上、下游引物5′端加入BamH Ⅰ 和Xba Ⅰ 酶切位点，上游引物：5′CTCGGATCCATGTGTCC TGGGGCACTGTGG3′，下游引物：5′CTCTCTAGACTACCTGCACCCACACTCTGC3′。RTPCR反应体系为50 μL，内含：5×QIAGEN OneStep RTPCR Buffer 10 μL；10 mmol/L dNTP 2 μL；5×QSolution 10 μL；上游引物（6 μmol/L） 5 μL；下游引物（6 μmol/L）

6期杨堃，刘相萍，隋爱华,等. 正常成人肝组织中BMP9读码框架的克隆521

5 μL；Enzyme Mix 2 μL；Total RNA 2 μg；加RNasefree water至50 μL。 逆转录反应条件：50 ℃ 30 min，95 ℃ 15 min灭活逆转录酶。PCR循环参数：94 ℃ 1 min、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，共35个循环，终末72 ℃ 延伸10 min。在10 g/L的琼脂糖凝胶上进行RTPCR扩增产物的电泳分析。

仔细切下琼脂糖凝胶中的目的条带，按QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit胶回收试剂盒操作步骤进行PCR产物的凝胶回收。

1.4 重组真核表达载体的构建及转化感受态大肠杆菌

将高效真核表达载体pcDNA4/HisMax和胶回收PCR产物分别行BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切。酶切反应产物纯化后，T4连接酶进行连接反应。连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109，氨苄青霉素抗性筛选。碱裂解法提取带抗性基因质粒。

1.5 重组载体限制性酶切分析及DNA测序

将所提取的质粒进行BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切鉴定,将初步鉴定为带有插入片段的重组质粒送往上海生工生物技术有限公司进行DNA测序。

2 结 果

2.1 RTPCR检测

以成人肝组织总RNA为模板进行RTPCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图1。产物大小约1.3 kb，符合人BMP9在GenBank中的开放读码框架序列大小。

2.2 重组载体限制性酶切分析

未经重组pcDNA4/HisMax载体经BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切后，产生约5.3 kb大小线性化载体DNA（图2）。重组pcDNA4/HisMaxBMP9载体经BamH Ⅰ与Xba Ⅰ双酶切后，产生约5.3、1.3 kb大小线性载体及BMP9两条片段（图2）。 2.3 DNA测序

将酶切鉴定后的重组质粒进行DNA测序，测序结果与BMP9在GenBank中的开放读码框架序列完全一致，表明获得的目的基因正确。

3 讨 论

BMPs为TGFβ超分子家族中的一个特殊亚族，其在皮下注射后具有诱导异位骨形成的能力。在发育和（或）生长过程中，BMP的信号传递对于生物体非常重要[3]。BMP9是引人关注的BMPs家族的一员，其在骨代谢及其他很多方面具有重要的临床应用价值。

BMP9首先从胎鼠肝cDNA文库进行了克隆，表现出与细胞特异性受体的结合特性[4]。MILLER等[4]描述了BMP9的细胞表达和受体结合特性。研究显示，成年鼠BMP9主要出现于肝脏。肝脏的非实质细胞、肝星形细胞和肝内皮细胞(LEC)等表达BMP9。研究发现，BMP9信号通过自分泌和（或）旁分泌机制在肝窦中触发。BMP9在减少肝细胞中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的表达和在肌管中激活丝苏氨酸激酶（Akt）有确切作用 [2]。

在神经系统中，BMP9的作用主要包括两方面。首先，BMP9促进胚胎原始神经元的乙酰胆碱合成[5]。来自胚胎鼠的原始细胞，在细胞培养中加入rhBMP9可呈时间浓度依赖增加细胞产生乙酰胆碱。还可诱导胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱小泡转运体的表达[6]。BMP9与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对神经系统发育起协调作用，bFGF促进原始细胞的增殖，保持原始细胞特性的一致，BMP9则促进细胞分化，保持种族特异性。

BMP9还在调节造血干细胞的生长中有双向作用[7]：体外高浓度BMP9有抑制体外克隆造血祖细胞集落形成单位的增长效应，低浓度BMP9则显著促进体外克隆造血祖细胞集落形成单位增殖。

本实验对人BMP9全长读码框架进行了完整克隆，获得了准确且纯度很高的重组载体，为这一多能细胞因子在创伤修复、内分泌、神经系统和造血系统等临床领域的转基因应用实验研究提供了坚实的基础。

【参考文献】

[1]WOZNEY J M, ROSEN V, CELESTE A J, et al. Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities[J]. Science, 1988,242:15281534.

[2]张凌,杨刚毅. 骨形态发生蛋白9临床研究进展[J]. 医学分子生物学杂志, 2004,1(2):119121.

[3]SONG J J, CELESTE A J, KONG F M, et al. Bone morphorgenetic protein9 binds to liver cells and stimulates proliferation[J]. Endocrinology, 1995,136:42934297.

[4]MILLER A F, HARVEY S, THIES R S, et al. Bone morphogenetic protein9 an autocrine/paracrine cytokine in the liver[J]. J Biol Chem, 2000,275(24):1793717945.

[5]LOPEZCOVIELLA I, BERSE B, THIES R S, et al. Upregulating of acetylcholine synthesis by bone morphogenetic protein 9 in a murine septal cell line[J]. J Physiol Paris, 2002,96(1):5359.

[6]LOPEZCOVIELLA I, BERSE B, KRAUSS R, et al. Induction and maintenance of the neuronal cholinergic phonotype in the central nervous system by BMP9[J]. Science, 2000,289(54):313316.