终末期肾病(ESRD)维持性血液透析(MHD)患者血中Lp(a)浓度显著高于正常人，遗憾的是多数降血脂的药物对高Lp(a)血症疗效并不显著，其原因与MHD患者高Lp(a)血症的发生机制未明有关。本文采用高分辨SDS-琼脂糖电泳连接免疫印迹法检测MHD患者apo(a)表型，针对常见的影响Lp(a)水平的因素选择相应的监测指标进行分析，探讨 MHD患者高Lp(a)血症发生机制。 1 材料与方法
1.1 研究对象
66例MHD患者均来自沈阳军区总医院2003-2004持续性透析治疗两年以上的患者，男38例，女28例，平均年龄54．5±20岁。51例ESRD患者选自沈阳军区总医院肾内科住院病人均没有经过血液透析、腹膜透析及肾移植治疗，男30例，女21例，平均年龄49.5±18岁。两组患者均除外急性创伤、恶性肿瘤、严重肝病、糖尿病等疾病。对照组(Control)62人均来自健康体检人群，其中男35例，女27例，平均年龄55.6±25岁，体检证实无心、脑、肾、肝等相关性疾病。
1.2 主要仪器与试剂
1.2.1 主要仪器
PowerPacTM Universal Power Supply(Bio-Rad)，Mini-PROTEIN 3 Cell转移电泳槽(Bio-Rad)， DYCP-31D型水平电泳槽(北京六一仪器厂)，AEROSET全自动生化分析仪(美国雅培)，IMMAG特种蛋白分析仪(美国贝克曼)等。
1.2.2 主要试剂
鼠抗人Apolipoprotein Lp(a)单克隆抗体(US Biological)，兔抗鼠辣根过氧化物酶标记抗体(北京中杉金桥)，超纯琼脂糖D-5(大连宝生物)，Lp(a)、LDL-C试剂(日本东纺)，胱抑索C(Cystatin C，CysC)(DakoCytomation)，C反应蛋白(C-reaction protein，CRP)试剂(美国贝克曼)，白蛋白(Alb)、肌酐(Crea)试剂(英国朗道)。
1.3 方法
1.3.1 标本采集
所有被检者均采集早晨空腹肘静脉血9ml，其中4 ml低速离心分离血清用于检测Lp(a)、CRP、Cy． sC、LDL-C、AIb、Crea等指标。另外4 ml 4000rpm离心分离血清放-70℃保存直至检测apo(a)表型。余下Iml放入EDTA-K2抗凝管中，混合均匀用于检测Hb。
1.3.2 Apo(a)表型检测
参照Marcovina SM等采用高分辨SDS-琼脂糖电泳连接免疫印迹法，略有调整。标准血清通过随机选取健康人群的血清，每4份血清混合后进行高分辨SDS-琼脂糖电泳连接免疫印迹法检测apo(a)表型。选择出含有电泳速度最快和最慢的血清，在同一琼脂板上电泳，测得电泳速度最快和最慢的条带之间的距离大约为68mm，由于表型检测中可区分的两个最近表型距离为2mm，把电泳速度最慢的表型称为1即最大apo(a)表型，而电泳速度最快的表型则为35即最小apo(a)表型。将含有1和35表型的两份血清混合作为标准血清。混合血清内含(1，15，24，35)表型。
1.3.3 apo(a)表型确定原则
参照Marcovina SM和Kronenberg F等方法确定apo(a)表型。测混合标准血清条带中最大apo(a)表型标准1和最小apo(a)表型35间的距离(A)，量出待测标本apo(a)蛋白带中心与最大apo(a)表型标准1的距离(B)，按公式[(34 × B)／A]+1计算确定表型。将只含有≤15表型的标本称为高分子量(HMW)表型，至少含有一个>15表型的标本视为低分子量( LMW)表型。
1.3.4 其它指标检测
本实验对CysC、CRP检测采用IMMAGE免疫化学分析仪。Crea、LDL-C、Alb、及Lp(a)采用AEROSET全自动生化分析仪。Hb检测采用贝克曼血液分析仪。实验参数按照相应产品说明书设置，操作严格按照操作规程进行。
1.4 统计学方法
各组计量数据中由于Lp(a)呈非正态分布，用中位数(M)来表示。并且在两组间比较时应用 Mann-Whitney U检验。其余呈正态分布的计量数据用均数±标准差(±SD)表示，两组间比较用t检验。各种生化指标与Lp(a)浓度的关系应用Spearman相关分析。在Lp(a)浓度经对数转化之后采用多元逐步线性回归分析。所有统计学计算通过SPSS11．5完成，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MHD、ESRD与Control组不同分子量apo(a)表型所对应Lp(a)浓度比较
相同表型不同组间Lp(a)中位数浓度比较如表1所示，HWM表型中MHD组与ESRD组和Conuol组Lp(a)中位数浓度比较均有显著性差异(P<0.05)。LWM表型中MHD组与ESRD组Lp(a)中位数浓度无显著性差异(P>0.05)但与Control组相比有显著性差异(P<0.05)。
2.2 MHD组、ESRD组与Control组其他检测指标比较
对MHD组、ESRD组与Control组的一些指标检测结果如表2所示。MHD组、ESRD组分别与Control组相比Crea、Alb、Hb、CRP、CysC检测结果均具有显著性差异(P<0.05)，而LDL-C结果无显著性差异。MHD组与ESRD组相比Crea、CRP、CysC结果存在显著性差异(P<0.05)，其他指标则无统计学意义。MHD组Lp(a)浓度水平与这些指标相关性分析结果如表3，结果显示在LWM表型中，Lp(a)浓度与Alb、CysC存在相关性(P<0.05)。在HWM表型中，与Lp(a)浓度相关的指标则是CRP和CysC，统计学检验示(P<0.01)。但就MHD组总体来讲，Lp(a)浓度则与Alb和CysC结果相关(P<0.01)。
2.3 MHD组影响Lp(a)水平的因素回归分析
由于Lp(a)浓度在正常人血液中为非正态分布，因此把所测定的Lp(a)浓度结果对数转换后作为因变量，以性别、年龄、Crea、Alb、Hb、LDL-c、CRP、CysC为自变量进行多元逐步线性回归。结果表明，就MHD组总体而言，表型、Alb、CysC进入了回归方程，确定系数为(R2)为0.348。其中表型对应的R2为0.121，CysC对应的R2为0.178，Alb对应的R2为0.049。也就是说除了基因对Lp(a)浓度的调控外，MHD组较Control组Lp(a)的浓度增高的这种变化的34.8％可以用这三种因素来解释(见表4)。
3 讨论
Lp(a)是一种独立的特殊的血浆脂蛋白，由apo(a)通过二硫键与LDL(LDL)连接而成，是导致动脉粥样硬化发生的独立危险因素。Lp(a)水平主要由apo(a)基因中KringleⅣ重复序列的多态性决定，LMW表型对应高Lp(a)浓度水平，HMWapo(a)表型对应低Lp(a)浓度水平。血液中Lp(a)的浓度是一个稳定的遗传标志，不受性别、年龄、理化因素及多种降脂药物影响，但是诸如肝脏功能状态、炎症反应、肾小球清除率等多种因素也可在一定程度上影响其浓度。MHD患者血中Lp(a)浓度显著高于正常人。MHD并发症较多，其中动脉粥样硬化性心脑血管疾病是最主要的并发症也是主要的致死原因之一。因此Lp(a)在MHD患者并发症的防治中的作用就越来越受到重视。
Lp(a)的代谢机制到目前为止仍不是很清楚，Kronenberg F通过对肾动、静脉Lp(a)浓度差异的确认证实，肾脏在Lp(a)代谢过程中起着重要作用。本实验研究发现，LMW apo(a)表型中MHD组 Lp(8)浓度与ESRD组相近，但与对照组相比却有显著性升高(P<0.05)。HMW apo(a)表型中，除了MHD组和ESRD组Lp(a)浓度均高于对照组外，MHD组Lp(a)浓度水平也明显高于ESRD组Lp(a)浓度(P<0.05)。由此可见，肾脏功能损害可使Lp(a)浓度增高，与上述观点一致。同时，我们发现，MHD治疗的患者Lp(a)浓度高于ESRD组Lp(a)浓度，并且以HMW apo(a)表型的Lp(a)浓度增高更为显著，说明MHD治疗可以促使HMW apo(a)表型Lp(a)增高，其机制可能与LMWapo(a)表型Lp(a)存在差异。
对于慢性肾功能衰竭患者高Lp(a)的浓度的原因，有很多猜测：1、慢性肾功能衰竭患者普遍存在白蛋白水平的降低，这可引起肝脏代偿性合成白蛋白的同时合成Lp(a)增加。2、肾小球滤过率的降低使Lp(a)在肾脏的排泄减少。3、慢性肾功能衰竭患者肾脏损伤后，肾脏分泌的促红细胞生成素减少是其对Lp(a)降低作用减少，同时也是慢性肾功能衰竭患者贫血的一个重要原因。4、急性炎症反应促使 Lp(a)升高，因为Lp(a)本身就是非常好的急性炎症反应蛋白。5、Lp(a)在某些特定的条件下可通过LDL受体代谢，LDL可以竞争性抑制Lp(a)的分解代谢。为了了解这些因素是否影响了MHD患者高 Lp(a)血症的发生，我们针对每一种可能引起Lp(a)的浓度升高的因素，选择了相应的监测指标。对MHD组、ESRD组与Control组的Alb、CysC、Crea、Hb、CRP、LDL-C等指标进行了检测，与Control组相比这些指标除LDL-C外，其余均有显著性差异，其中Crea、CRP、CysC高于Control组而Alb、Hb则低于Control组。与ESRD组相比，MHD组Crea、CRP、Cysc显著增高。Alb、Fib及LDL-C所检测到的结果与其他报道有所不同，原因可能在于慢性肾功能衰竭患者现在多已经注重对高血脂、低蛋白和贫血的治疗，都不同程度上服用了相应的治疗药物进行了纠正所致。
我们对这些检测指标结果及性别、年龄等特征指标为自变量，以对数转化的Lp(a)的浓度为因变量做多元逐步线性回归分析。结果表明，就MHD组总体而言，表型、Alb、CysC进入了回归方程，确定系数为(R2)为0.348。其中表型对应的R2为0.121，CysC对应的R2为0.178，Alb对应的R2为0.049。也可以说除了基因对Lp(a)浓度的调控外，MHD组较Control组Lp(a)的浓度增高的这种变化的34．8％可以用这三种因素来解释。MHD组患者血中高Lp(a)的浓度可能是由于低白蛋白血症，促使肝脏合成白蛋白的同时连带合成apo(a)。肾小球滤过率的降低也使Lp(a)的代谢受到了限制。在Lp(a)的合成或分解过程中，由于apo(a)表型的差异，在一定程度上增加了Lp(a)的浓度。对于LMW apo(a)表型，进入方程的只有Alb(R2为0.209)，观察Lp(a)与其他指标相关性研究(表3)，我们可以发现，LMW apo(a)表型中Lp(a)与CysC之间存在相关性(r=0.379，P<0.05)，t但其并没有进入回归方程，可能是相对于肝脏合成Lp(a)增加的原因，CysC所起的作用较小所致。在HMW apo(a)表型回归中，CRP、CysC进入方程并且总R2为0．473，其中CysC对应的R2为0．343，CRP为0.130。急性炎症反应和肾小球滤过功能降低在很大程度上影响了Lp(a)的浓度。
由此可见，导致维持性血液透析患者高Lp(a)水平的机制是多种因素共同作用的结果，而且不同表型的Lp(a)升高原因存在差异，临床上可针对不同表型采取不同措施，以达到更好的治疗效果。
参 考 文 献
[1] 刘虹，彭佑铭，高雷，刘伏友，刘映红.维持性血液透析患者颈动脉硬化及相关因素分析[J].中国血液净化.