低氧预适应是指轻度低氧和短暂缺血的重复预处理触发和动员机体内在的防护能力，从而对随后的严重低氧或缺血损伤产生强大的防御和保护作用[1]。在整体动物脑缺血预适应中，星形胶质细胞可能释放多种因子，作用于神经元[2-3]，但其具体的作用机制尚不清楚。研究表明，在低氧预处理后离体及在体动物均发生反应性星形胶质细胞增生，其作用可能与β-catenin的过度激活有关[4-5]。我们在前期工作中亦发现，β-catenin可促进(30±20)mL/L低氧条件下体外培养的神经前体细胞和胶质前体细胞增殖，并可在低氧培养的星形胶质细胞中积聚[6]，但其作用机制尚未明确。本实验选用海马星形胶质细胞，探讨低氧培养条件下，星形胶质细胞内β-catenin积聚的可能机制。
1材料与方法
1.1材料DMEM/F12、胎牛血清(FBS)购自Hyclone公司，兔抗胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)多抗购自Sigma公司，羊抗β-catenin抗体、兔抗β-actin抗体、抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体、抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体(Santa Cruz)、辣根过氧化物酶标记兔抗山羊IgG、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自Santa Cruz公司，SuperSignal West Pico化学发光检测底物试剂盒购自Pierce公司，RT-PCR试剂盒、Trizol购自Invitrogen公司，SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒购自北京中杉公司，新生昆明小鼠由南京军区福州总医院比较医学科提供，SPF级。
1.2方法
1.2.1昆明小鼠海马星形胶质细胞的分离、培养及鉴定选用2d龄小鼠，750mL/L乙醇浸泡消毒后迅速断头取脑，置于盛有D-Hanks液的玻璃培养皿中，用眼科剪剪去头部皮肤和颅骨，仔细去除脑膜和血管，剥离出大脑半球，用D-Hanks液清洗2次;在解剖显微镜下小心分离海马组织，置于另一盛有D-Hanks液的培养皿中。用眼科剪将海马组织剪碎成糊状，转移至带螺帽的离心管内，加入终浓度为1.25g/L胰酶，置于37℃水浴消化15～30min，每隔5min振荡1次，以含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目不锈钢筛网过滤，制备混合细胞悬液;收集于无菌离心管中，1000r/min离心5min，弃上清。加入含100mL/L FBS的DMEM/F12培养基，将细胞密度调整为3～5×105个/mL，接种于50mL培养瓶内。置于37℃，饱和湿度，50mL/L CO2培养箱中培养，2～3d后换液。
1.2.2星形胶质细胞的纯化及鉴定培养7d后，贴壁细胞融合达90%以上，利用胰酶消化法传代，继续培养，连续传代3次后，所得细胞即是星形胶质细胞。鉴定时，将细胞接种于12孔板内的盖玻片上，3d后取出爬满细胞的盖玻片，进行GFAP免疫细胞化学鉴定(SP法)，步骤简述如下：PBS漂洗，以40g/L多聚甲醛液固定30min;PBS漂洗，5min×2次;30mL/L H2O2孵育5min;滴加封闭用正常山羊血清工作液，室温孵育15min;倾去，勿洗;滴加兔抗GFAP多克隆抗体(1∶100)，置于湿盒内4℃过夜;PBS洗，3min×3次;滴加生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育60min;PBS洗，3min×3次;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育60min;PBS冲洗，3min×3次;DAB显色后脱水，透明封片并镜检。阴性对照将PBS替换一抗，其余步骤相同。
1.2.3星形胶质细胞的低氧培养将6孔板内的细胞置于50mL/L O2，50mL/L CO2/N2的低氧培养箱内培养12h和24h后，待细胞密度达80%以上融合后，取出细胞，进行相关指标检测。常氧培养的细胞为对照组，各组细胞各取3孔，分别进行3次实验。
1.2.4RT-PCR法检测星形胶质细胞中Wnt3和Wnt3a的表达用Trizol提取细胞总RNA;应用引物设计软件Primer Premier5.0设计引物，由赛百盛生物技术有限责任公司合成(表1)。cDNA合成和PCR扩增反应：2.0μg RNA，2.0μL Oligo(dT)15，2.0μL dNTP，0.25μL RNasein，0.5μL AMV反转录酶，4.0μL 25mmol/L MgCl2，4.0μL 5×buffer，加灭菌三蒸水至总体积20μL，42℃ 1h，选定扩增循环数为30。取逆转录cDNA 4.0μL，10×扩增缓冲液5.0μL，MgCl2 3.0μL，dNTP 3.0μL，上、下游引物10pmol，Taq DNA聚合酶1.0μL，加灭菌三蒸水至总体积50.0μL。在PCR仪上扩增，反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃(Wnt3)、53℃(Wnt3a)30s，72℃ 60s。扩增35循环。全部周期结束后于72℃延伸8min。内参基因为GAPDH。阴性对照组以去离子水取代cDNA模板，其余条件相同。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，利用凝胶图像分析系统进行分析。
1.2.5蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)检测各组星形胶质细胞中β-catenin、p-Akt和p-GSK-3β的表达分别提取各组星形胶质细胞总蛋白。取20μg样品蛋白100℃变性5min，行SDS-PAGE凝胶电泳。半干转膜(15V，60min)，50g/L脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入抗β-catenin单克隆抗体，抗磷酸化Ser473位点Akt单克隆抗体，抗磷酸化Ser9位点GSK-3β单克隆抗体，稀释比例均为1∶200，4℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的抗兔/羊IgG(1∶1000)，室温孵育1h后，行化学发光检测，采用凝胶成像系统分析其相对吸光度(A)值，以β-actin作为校正。表1引物序列Tab.1Sequence of primers基 因引物产物长度学术论文发表
1.3统计学处理采用Bandscan软件对RT-PCR和WB所得条带进行吸光度扫描。实验数据以均数±标准差(±s)表示，结果采用SPSS统计软件对两样本均数进行t检验，P<0.05为有显著性差异。
2结果
2.1小鼠海马星形胶质细胞的培养、纯化及鉴定海马组织细胞培养1h后开始贴壁。随着培养时间延长，细胞体积逐渐增大，伸出突起，呈聚集性生长，以梭形和多角形细胞为主。1周左右，原代细胞基本融合。连续传代培养3代后，细胞形态逐渐变得单一，为梭形或星形，胞质丰富，核大，境界清楚。染色质浅、均匀，有1～2个核仁，居于核中央(图1A)。GFAP的免疫细胞化学检测表明，GFAP表达主要位于胞质和突起内，胞核呈空泡状，不显色(图1B)。阳性细胞统计接近100%，表明培养的星形胶质细胞纯度已达实验要求。图1海马星形胶质细胞的鉴定Fig.1 Identification of hippocampus astrocytesA：相差倒置显微镜下(×400);B：GFAP的免疫细胞化学(SP, ×200)。
2.2低氧对β-catenin蛋白表达的影响经WB检测，与常规培养相比，星形胶质细胞经低氧培养12h和24h后，β-catenin蛋白表达均较常氧组增加(P<0.05，图2)。图2WB检测β-catenin表达Fig.2 Effect of hypoxia on the expression of β-catenin1：常氧培养;2：低氧培养12h;3：低氧培养24h。
2.3低氧培养对星形胶质细胞内Wnt3和Wnt3a表达的影响RT-PCR检测结果显示，常氧培养的星形胶质细胞内检测到Wnt3表达，但未检测到Wnt3a的表达;低氧培养24h后，星形胶质细胞内Wnt3的表达与常氧组相比，有下降的趋势;而Wnt3a表达仍未检测到(图3)。图3低氧培养前后Wnt3和Wnt3a表达的变化Fig.3 Effect of hypoxia on the expression of Wnt3 and Wnt3a1：Marker;2、4：常氧组Wnt3、Wnt3a;3、5：低氧组Wnt3、Wnt3a。
2.4WB检测p-Akt和p-GSK-3β蛋白的表达情况
低氧培养12h和24h后，p-Akt蛋白和p-GSK-3β蛋白水平均升高，与常氧培养组相比，有显著性差异(P<0.05，图4)。图4WB检测低氧对p-Akt和p-GSK-3β蛋白表达的影响Fig.4 WB detected the expression of p-Akt and p-GSK-3β induced by hypoxia1：常氧组;2：低氧培养12h;3：低氧培养24h;与常氧组比较，*P<0.05，**P<0.001。
3讨论
研究发现星形胶质细胞表面不仅具有电压依赖的Na+、K+及Ca2+通道[7]，而且分布着许多神经递质、神经肽、激素及神经营养因子受体，并能合成及分泌多种神经活性物质，在维持神经元内外环境、生存、迁移、免疫调节、信号转导、轴突生长及功能整合等方面具有重要作用。在某些病理条件(如缺氧)下，星形胶质细胞可发生反应性增生，活化的星形胶质细胞对神经系统功能起保护或毒性作用[8]。
β-catenin作为多种信号通路的关键分子，可通过诱导其下游靶基因(如CyclinD1、c-myc)的表达促进细胞增殖。本研究发现β-catenin可在低氧培养的星形胶质细胞内积聚。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长增殖的关键途径，且在低氧状态下具有调节胚胎前体细胞增殖、分化的功能。经典Wnt/β-catenin信号通路信号分子主要包括Wnt蛋白、Frz、β-catenin、Axin、GSK-3β、LEF/ TCF和靶基因(如CyclinD1、c-myc)。β-catenin在经典Wnt信号通路中处于中心地位，其激活或降解会导致Wnt信号通路变化[9-10]。人类基因组中已经发现Wnt基因19种，分别命名为Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a等[11]。LIE等[12]报道检测到成体海马内星形胶质细胞具有表达Wnt3的能力。本实验采用传代培养筛选获取海马星形胶质细胞，分别于常氧和低氧条件下培养。RT-PCR检测结果表明，常氧培养的成体海马星形胶质细胞内表达Wnt3，但 Wnt3a无表达。低氧培养时，仍未检测到 Wnt3a的表达，而Wnt3的表达下降。表明低氧条件并未上调海马星形胶质细胞内主要的Wnt蛋白的表达。因此，推断在低氧情况下可能存在其他未知的引发β-catenin积聚的因素。学术论文发表
PI3K/Akt信号转导通路是一条参与细胞增殖调控的重要信号通路。PI3K和Akt是该通路的中心环节。研究证实PI3K/Akt信号通路不仅参与胚胎干细胞的增殖分化调控，而且参与多种细胞缺氧后的增殖[13]。但是，对于该信号途径在星形胶质细胞的作用知之甚少。Akt是一种丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，是PI3K重要的下游分子。Ser473或/和Thr308位点的磷酸化是Akt激活的必要条件，而Akt激活是其发挥促细胞生存功能的重要前提。激活的Akt主要通过促进GSK-3β等下游底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应，包括抗凋亡、促细胞增殖等功能。GSK-3β磷酸化是调控GSK-3β功能状态的最主要机制。GSK-3β是β-catenin重要的调节因子，多种细胞外的应激信号均可通过PI3K/Akt途径调控GSK-3β的活性，间接导致β-catenin积聚。
本实验WB检测结果显示，低氧培养12h和24h后，星形胶质细胞内GSK-3β蛋白磷酸化和Akt蛋白磷酸化水平均升高，与常氧培养组相比，有显著性差异(P<0.05)，提示低氧可能通过PI3K/Akt信号途径增加星形胶质细胞内β-catenin积聚。