【论文关键词】氘标记 青霉素结合蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳 荧光放射自显影【论文摘要】当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对β-内酰胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(PBPs)改变造成的耐药性,是β-内酰胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs
当前,细菌耐药性问题日趋严重,给临床治疗带来困难,对卜内酞胺类抗生素而言,某些菌青霉素结合蛋白(PBps)改变造成的耐药性,是卜内酞胺类抗生素的特点。一般细菌的PBPs均为胞浆膜上的蛋白质,是细菌致死的靶位。它的数目、位置、亲和力的变化造成与卜内酞胺类抗生素不易结合而产生耐药性。人们常采用SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳和放射自显影的方法研究PBPs图谱,以便了解敏感菌和耐药菌的区别。所以,PBPs测定技术是研究压内酸胺类耐药性的重要手段[l]。的穿透力弱,用一般放射自显影法不能获得PBPs图谱,需采用荧光闪烁剂增效的“荧光放射自显影法”。国内有关PBps测定技术报道甚少,以3H标记者更少,本文介绍这一技术。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种肺炎链球菌31003,30301(北京药品生物制品检定所;Pen08.R6本室保存菌种。
1.1.2培养基C+Y培养基,参见文献(2)。
1.1.3仅器及药品
垂直板凝胶电泳槽(吴县科研仪器厂);NG一l型真空凝胶干燥器(太仓电视机厂);TGLL一1a型台式高速冷冻离心机(中科院上海生物化学研究所);8438一超低温冰箱(FormaSclentifi。,美国);电泳仪DY一1型(上海医用分析仪器厂);丙烯酞胺(Aerylamide,临海止学厂产);甲撑双丙烯酞胺.(big;瑞士产品);N,N,N,N一四甲基乙二胺(TEMED,上海前进农场制剂厂);3H标记青霉素乙酞呱陡盐(NewEngiandNuclear,美国);x光底片(天津感光材料厂;KodakDiangnostiefilmX一OmatAR13X18em);2,5一二苯基嗯哇(PPO,闪烁纯,上海试剂一厂);月桂酞肌氨酸钠(Sarkosyl,Sigma);十二烷基硫酸钠(SDs,上海新华化工厂);二甲基亚矾(DMso,北京旭东化工厂)。
1.2方法
1.2.1肺炎链球菌PBPs样品的制备将肺炎链球菌按种c+Y培养基37℃过夜培养,次日再移种新鲜培养基中,37℃培养2~3h至对数生长期,菌数约为个/ml(CFU/ml),菌液分装试管,每管lml于冰浴中加入不同浓度的氖标记青霉素37℃保温10min,在冰浴中加入5非标记青霉素G钠盐20万单位/ml,冷冻离心5000:/minlom仇,弃去上清,菌体沉淀用50以磷酸缓冲液(PH6.8)做成菌悬液,然后加入5一10拼一20%sarkosyl,37℃保温10min使细胞溶解,加入30协一样品缓冲液,煮沸3min,置室温备用。
1.2.2聚丙烯鱿胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDSPAGE)方法。制备凝胶薄片(厚0.2cm),凝胶配方:分离胶(10%):Aerylamide:bis(30:0.5)6.7ml,Tris(pH8.8,1.5ml/ l)5ml,10%SDS 0.2ml,蒸馏水8.1ml,真空搅拌10一15min除去气体,再加入TEMED,浓缩胶(5%):按上述配方依次为1.7ml,2.5ml,0.1而,5.6ml,7.5,和150。先配制分离胶,灌注直立式电泳槽后,使凝胶凝固。次日加入浓缩凝胶,放入加样梳,静置2h。在加样槽内依次分别加入PBps样品。接通电流,第一小时维持电压在60v,至染料前沿到达分离胶和浓缩胶交界处调高电压至120v,走完全程约需3一4h,用考马斯蓝R250染色30一45min,过夜脱色。
1.2.3关光放射自显影方法凝胶片用二甲基亚矾(DMSo)处理30min,再用新鲜DMSo再次处理30而n,20%即。处理2一3h,l%甘油和1%乙酸处理lh,将凝胶片贴附在厚滤纸上,使用凝胶真空干燥器进行真空干燥,将凝胶片和x光底片贴紧,置于x光射线暗匣内,放超低温冰箱一70℃使曝光1~Zwr,将x光底片显影,定影,冲洗得到PBPs的放射自显影图谱。x光底片预曝光条件:(1)国产x光底片用照相闪光灯红色滤光片,加6层红色玻璃纸滤过,x光底片上覆盖6层红色玻璃纸,距离50cm,闪光灯闪二次;(2)进口x光底片预曝光用x光机最小功率100mA40kV,距离40em,每张x光底片曝光0.04s。转 1.2.4竟争性结合试验定量菌液中分别加入不同浓度的甲氧西林保温37℃10min,然后加入饱和量的氛标记青霉素,37℃保温10min,再按上述方法继续进行实验。
2结果与讨论
本法测定肺炎链球菌全细胞中pBps的含量,首先需要分离菌体蛋白,为使菌体蛋白浓度维持在一定的水平上,必须控制菌龄和菌液浓度。菌液浓度约CFU/ml。肺炎链球菌破碎细胞的方法以采用离子型去污剂sarkosyl为宜,它能选择性地作用于胞浆膜(3),使胞浆膜破裂,菌体蛋白释放出来,与此同时,已经与青霉素结合的膜蛋白PBPs也一起释放出来。样品制备完毕,煮沸3min,以便除去某些蛋白质的干扰,青霉素与PBPs结合较牢固,不会被破坏。
本实验采用SDS一PAGE方法(4-5),SDS在分离胶与浓缩胶中的终浓度均为0.1%。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%。
氖标记物穿透力较弱,用一般放射自显影方法不能得出图象,本实验采用荧光放射自显影法(6-8)(Fluoro,aphy),检测聚丙烯酞胺凝胶片上3H标记的蛋白质,有一定的优点。PPO是荧光增效剂,其作用原理不是直接依赖sH放射出来的日射线,而是藉助3H上的日粒子与PPO相互作用发射出的光,造成x光底片的局部发黑得到深浅不同的暗线,从而获得青霉素结合蛋白的图谱。肺炎链球菌的PBPs图谱上可见有三条区带,即p即;(a,b),pBpZ和pBp3。一般情况下,青霉素浓度越大,亲和力越强,颜色越深,在竞争性试验中,甲氧西林浓度越大,亲和力越强,颜色越浅。
据报道(7-9),x光底片预曝光可增加荧光放射自显影法的灵敏度,.因为预曝光可以纠正样品放射性和x光底片图象吸收值之间的非线性关系,所以,经预曝光的x光底片上所得到的图象可以正确反映出样品的放射性分布情况。
用国产x光底片不经预曝光时,无图象出现,经预曝光则有图象出现(见图1),用进口x光底片未经预曝光者,图象的暗线区别不大(见图2)。预曝光后的x光底片显示出暗线深浅不同的正确图象(见图3)。国产x光底片与进口x光底片比较,国产片敏感性较低,预曝后的x光底片上出现的暗线普遍较浅且细,PBPI。不可见。
参考文献
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