【摘要】 目的 探讨卡维地洛在动脉粥样硬化病变中的抗氧化作用及其对增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFκBp65）活化的影响。方法 雄性新西兰大耳白兔24只，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组8只，共计喂养10周。实验结束后，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清超氧化物歧化酶（SOD），硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛（MDA）,并采用免疫组化的方法测定血管壁PCNA及NFκBp65的表达。结果 高脂组和卡维地洛组血清三酰甘油和胆固醇较正常组明显升高（F=146.25、287.83,q=14.76～20.75,P<0.01），而该两组间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P>0.05）。高脂组较正常组SOD明显降低，MDA明显增加，而卡维地洛组较高脂组SOD有所升高，MDA有所降低（F=21.65、75.64,q=4.98～24.29,P<0.01）。高脂组PCNA和NFκBp65的表达较正常组明显增加，卡维地洛组PCNA和NFκBp65的表达较高脂组明显减少（F=426.12、521.38,q=56.15～75.87,P<0.01）。PCNA和NFκBp65的呈正相关（r=0.975，P<0.01）。结论 卡维地洛有减轻脂质过氧化损伤的作用，可阻断NFκB的活化，进而抑制平滑肌细胞的增殖。
【关键词】 动脉硬化 卡维地洛 抗氧化剂 细胞增殖 兔
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of carvedilol on antioxidation and activation of PCAN and NFκB on atherosclerosis.MethodsTwentyfour male New Zealand white rabbits were randomly pided into three groups: normal group, highfat diet group and cavediloltreated group, with eight rabbits in each group. All the rabbits were fed for 10 weeks. After completion of the experiment, the levels of serum triglyceride and cholesterol were measured by enzymatic method, of serum SOD by xanthine oxidative technique, and of serum MDA by thiobarbituric acid method. Expression of the PCAN and NFκBp65 in the vascular wall was detected immunohistochemically. ResultsCompared with those of normal rabbits, the levels of serum triglyceride and cholesterol of the highfat diet and cavediloltreated were extremely high （F=146.25，287.83； q=14.76-20.75； P<0.01), but no statistical difference was found between the latter two groups （q=0.53，0.59; P>0.05). Lowlevel serum SOD and highlevel serum MDA were noticed in highfat diet rabbits. In highfat diet group, SOD was lower than that in normal group, and MDA was higher; in cavediloltreated group, SOD was higher, and MDA was lower as compared with normal group （F=21.65，75.64; q=4.98-24.29; P<0.01）. The expression of PCNA and NFκBp65 in highfat diet group was markedly increased as compared with the normal group; but the expression was decreased in carvedilol group as compared with highfat diet （F=426.12，521.38; q=56.15-75.87； P<0.01）. An analysis showed that a positive correlation existed between PCNA and NFκBp65. Conclusion Carvedilol might relieve the lipid peroxidation injury and block NFκB activation so as to inhibit the proliferation of smooth muscle cells.
［KEY WORDS］ atherosclerosis; carvedilol; antioxidants; cell proliferation; rabbits
动脉粥样硬化(AS)是许多心脑血管疾病的基础性病理表现,也是中老年人常见疾病之一，严重威胁着人类的健康。氧化损伤是AS病变过程中核心环节，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。卡维地洛是具有多种药理活性的第三代β受体阻滞剂，除具有非选择性β受体阻滞作用外，还有α1受体阻断作用。近年来的研究表明，卡维地洛具有较强的抗氧化作用，这使其在抗AS病变中具有重要意义。本实验通过高脂饮食加免疫损伤内皮的方法诱发家兔AS模型，观察卡维地洛对AS病变过程中脂质过氧化损伤、增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFκBp65）表达的影响，进一步阐述其抗AS作用机制，从而为临床治疗AS提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
卡维地洛（金洛）由齐鲁制药有限公司提供，批准文号：国药准字H20000100；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PCNA和NFκBp65及相关SP试剂盒购自武汉博士德生物工程研究所。
1.2 主要仪器
上海精密仪器厂721型分光光度计，美国Lambert公司石蜡切片机，日本Olympus公司显微照相装置，德国欧波同公司VIDAS 21图像分析系统。
1.3 实验动物分组
健康雄性新西兰大耳白兔24只（购于华中科技大学同济医学院实验动物学部，合格证号：医动字第19025号），体质量（2.50±0.25）kg，分笼饲养，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组8只。
1.4 模型的制备及药物干预
家兔适应性喂养1周后，高脂组和卡维地洛组均一次性经耳缘静脉注射牛血清清蛋白250 mg/kg，然后均行高脂饮食。高脂饲料配方为：1 g胆固醇+5 g猪油+94 g普通饲料。另外，卡维地洛组每日清晨行卡维地洛10 mg/kg灌胃。正常组行普通饲料喂养（100 mg/d）。各组家兔共喂养10周。
1.5 血液标本的采集及测定
喂养10周后，各组动物分别行250 g/L乌拉坦（4 mL/kg）腹腔麻醉，沿胸骨正中线纵向剖开胸腔暴露心脏，直视下行右心室穿刺抽血，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清SOD，硫代巴比妥酸比色法检测MDA，各操作步骤严格按说明书进行。
1.6 局部病理标本的取材及检测
全血采集完毕后气胸处死动物，游离主动脉至髂总动脉分叉处，仔细清除血管壁脂肪及结缔组织，纵向剖开血管壁暴露内膜表面，铺平。高脂组、卡维地洛组在主动脉弓病变处取材，大小约1.0 cm×0.5 cm，正常组亦在主动脉弓处取材，其大小也约1.0 cm×0.5 cm，分别放入100 g/L中性多聚甲醛中固定，并逐步脱水，透明，浸蜡，包埋制成蜡块。每一标本连续切片两张，分别行PCNA及NFκBp65免疫组化检测，免疫组化采用SP法，DAB显色，操作步骤严格按照说明书进行。
PCNA及NFκBp65阳性表达主要在细胞核内，VIDAS 21计算机图像分析系统测定一定面积阳性信号值和阳性信号平均吸光度，并计算二者乘积，即积分吸光度。测定时每一病理切片在高倍镜下随机取10个视野，取其平均值。
1.7 统计学分析
数据以±s表示，用SPSS 11.5进行方差分析，变量间相关性检验采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 各组三酰甘油和胆固醇水平比较
高脂组、卡维地洛组血清三酰甘油及胆固醇水平均明显高于正常对照组（F=146.25、287.83,q=14.76～20.75,P<0.01），而两组之间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P>0.05）。见表1。
2.2 各组血清SOD活性和MDA含量比较
高脂组SOD活性较正常组明显降低，MDA明显增加，而卡维地洛组SOD较高脂组则有所升高，MDA有所降低，差别有高度统计学意义（F=21.65、75.64,q=4.98～24.29,P<0.01）。见表2。
2.3 免疫组化检测结果
PCNA和NFκBp65阳性染色定位于细胞核，染成棕褐色，正常组阳性着色很少见。高脂组PCNA和NFκBp65阳性染色主要分布在内膜及中膜靠近内膜处，较正常组和卡维地洛组明显增多，差别有高度统计学意义（F=426.12、521.38,q=56.15～75.87,P<0.01）。见表3。相关分析结果，PCNA与NFκBp65呈正相关（r=0.975，P<0.01）。表1 各组家兔血脂水平比较表2 各组家兔血清SOD及MDA水平比较表3 各组家兔主动脉血管壁PCNA及NFκBp65半定量结果比较 3 讨 论
AS为一较为复杂的病理学进程，其核心机制为脂质过氧化损伤血管壁，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。卡维地洛具有明显的抗氧化效应，因此在抑制AS病变的过程中发挥重要的作用。
3.1 卡维地洛对血脂及脂质过氧化的影响
AS病变形成的一个常见原因即为高脂血症，本实验的研究结果显示，卡维地洛对血三酰甘油及胆固醇无明显影响，说明其抗AS作用不是通过影响血脂代谢而实现的。SOD与MDA是反映AS进展过程中氧化损伤的可靠指标。SOD是体内维持氧自由基产生与灭活的主要酶类，是清除氧自由基的“清道夫”；MDA是脂质过氧化生成的一种醛基，AS时其在血液中含量直接反映出氧化损伤的程度。本实验研究结果表明，AS病变过程中存在脂质过氧化现象，而卡维地洛具有明显的抗氧化效应。目前的研究表明，卡维地洛抗氧化作用的活性部位为其分子结构上的咔唑基，其抗氧化作用的机制主要表现为：①抑制内源性抗氧化剂Vit E和谷胱甘肽的清除；②与细胞膜上的Fe3+螯合，从而阻止由DHF/Fe3+ADP和Fe/Vit C介导的氧自由基产生及其所致细胞膜上LDL氧化［1］；③作用于膜磷脂，降低膜对自由基的亲和性,并能镶嵌在脂质双层膜较深的位点上，使咔唑基接近脂质氧化的非饱和脂肪酸侧链的位点,从而发挥其抗氧化作用。此外，卡维地洛的代谢产物（SB211475和SB209995）抗氧化作用是卡维地洛的30～80倍,是Vit E的1 000～10 000倍［2］。
3.2 卡维地洛对PCNA和NFκBp65表达的影响
PCNA又称周期素,主要表达于处在增殖状态的细胞。细胞周期受控于PCNA,它作为生长因子的感受器,与周期蛋白依赖性激酶结合为外源信号的整合器,诱导蛋白磷酸化,从而调控细胞周期进程［3］。NFκB是将信息从胞浆传至胞核引起相应基因表达的重要的转录因子，它是由多肽链p65和p50蛋白亚基构成的二聚体,包括p50二聚体、p65二聚体和p50p65异源二聚体,主要发挥生理作用的是p50p65异源二聚体［4］。本实验即通过检测NFκBp65以明确AS病变中NFκB的活化程度。细胞处于静止状态时NFκB位于细胞质中，当机体受到外界因素如细胞因子、磷脂、脂糖、病毒、植物凝集素刺激时,在蛋白激酶核蛋白磷酸酶的作用下,IkB发生磷酸化,从NFκB二聚体上解离暴露p50单靶的核定位信号,NFκB得以激活,并移位入细胞核,与DNA链上调控众多因子转录的启动位点特异结合,启动基因转录［5］。有研究表明，在有丝分裂原（AngⅡ、FGF等）诱发的平滑肌细胞增殖的过程中，存在蛋白激酶C（PKC）NFκB信号转导通路，NFκB活化后可以结合在细胞cyclinD1的启动子而激活其转录，从而介导平滑肌细胞的增殖［6］。本实验的研究结果显示，NFκBp65与PCNA呈正相关，也说明了NFκB可介导平滑肌细胞的增殖。卡维地洛抑制NFκB活化的作用可能与其抗氧化效应有关。HINZ等［7］研究发现，氧自由基可使IkB磷酸化降解而游离出NFκB进入核内,从而发挥其促平滑肌细胞增殖的作用。卡维地洛强烈的抗氧化作用，可清除AS病变过程中氧化损伤所释放的氧自由基，进而阻断其NFκB的活化，由此可抑制平滑肌细胞增殖。
总之，卡维地洛抗AS作用与其抗氧化作用密切相关，主要表现为抑制AS病变过程中的脂质过氧化，清除氧自由基，阻断NFκB的活化，进而阻断平滑肌细胞的增殖。
【参考文献】
［1］OLIVERA P J， COXITO P M， RELO A P， et al. Inhibitory effect of carvedilol in the highconductance state of the mitochondrial permeability transition pore ［J］. Eur J Pharmacol，2001，412（3）：231237.
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［4］RITCHIE M E. Nuclear factor κB is selectively and markedly activated in humans with unstable angina pectoris ［J］. Circulation, 1998,98:17071713.
［5］GUTTRIDGE D C, ALBANESE C, REUTHER J Y, et al. NFkappa B controls cell growth and differentiation through transcriptional regulation of cyclinD1 ［J］. Mol Cell Biol, 1999,19(8):57855789.
［6］RAMANA KV， CHANDRA D， SRIVASTAVA B， et al. Aldose reductase mediates mitogenic signaling in vascular smooth muscle cells ［J］. J Biol Chem， 2002，277（35）：3206332070.
［7］HINZ M， KRAPPMAMN A. NFκB function in growth control: regulation of cyclin D1 expression and G0G1 to S2 phase transition ［J］. Mol Cell Biol， 1999，19：2690.