【摘要】 目的 探讨应激状态下大鼠肠黏膜基质金属蛋白酶13（MMP13）和层粘连蛋白（LN）的改变及意义。方法 Wistar 大白鼠60只，随机分为3组，每组20只。实验组制备肠缺血再灌注模型，对照组只进行同样腹部手术操作但不夹闭肠系膜上动脉，正常组不手术。6 h后处死大鼠，取距回盲部15 cm处肠管1 cm，常规组织切片，苏木精伊红染色观察肠黏膜组织细胞学形态；用免疫组织化学方法染色显示肠黏膜组织或细胞中LN、MMP13的表达情况，并用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果 苏木精伊红染色显示：实验组与对照组相比，肠壁变薄，上皮细胞水肿明显，部分坏死脱落，中性粒细胞及淋巴细胞浸润。免疫组织化学染色显示：实验组肠黏膜组织中MMP13表达较对照组增高，基底膜LN表达较对照组降低，差异有显著性（t=3.31、3.46，P<0.01），而对照组与正常组相比差异无显著性（P>0.05）。结论 缺血再灌注可使肠黏膜组织中MMP13水平表达增高，进而使其降解底物LN水平降低，肠黏膜萎缩及通透性增大，导致肠屏障功能损伤。
【关键词】 再灌注损伤 肠屏障 层粘连蛋白 基质金属蛋白酶类
［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate changes of expressions of LN and MMP13 in impaired intestinal mucosa during stringent state.MethodsSixty Wistar rats were evenly randomized into three groups: experimental, control, and normal control. For experimental group, a model of postischemicreperfusion intestine was established by clamping the superior mesenteric artery; for control group, a laparotomy was merely done without clamping any arteries; for those in normal control group, received nothing. A 1cmlong segment of intestine, 15 cm above the ileocecal junction, was dissected 6 hours later, and a tissue section made as routine. Immunohistochemical study was used to observe the expressions of MMP13 and LN and VIDAS image analysis system applied for semiquantitative detection.ResultsThe thinner enteric wall, edematous epithelium with neutrophils and lymphocytes infiltration, shorter intestinal villi were obviously noticed in the experimental group compared with the other two. Immunohistochemically, the expression of MMP13 in the experimental was higher and the expression of LN was lower compared with those in the control (t=3.31，3.46;P<0.01）.ConclusionPostischemic reperfusion may elevate the expression of MMP13 in intestinal mucosa and leads to lower expression of LN, shrink the mucosa and increase its permeability, thus damage the intestinal mucosal barrier.
［KEY WORDS］reperfusion injury; intestinal mucosal barrier; laminin; matrix metalloproteinases
正常情况下，肠屏障是指肠道能防止肠腔内的有害物质如细菌和毒素穿过肠黏膜进入体内其他组织器官和血液循环的结构和功能的总和。机械屏障是肠道屏障的重要组成部分[1],同时也是诸如免疫屏障、生物屏障等肠道屏障其他组成部分的物质基础，是肠屏障功能维持的关键。机械屏障由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成[2]。层粘连蛋白（LN）是细胞外基质中的非胶原糖蛋白，广泛分布于基底膜的透明层，参与基底膜的构成并对维持其结构、功能的完整起重要作用[3]。本文通过制备大鼠肠缺血再灌注模型，对可以水解LN的基质金属蛋白酶13（MMP13）进行观察，以了解应激时它们在肠黏膜中的表达情况和它们之间的相关性。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康Wistar大白鼠60只，雌雄不限。随机分为实验组、对照组和正常组，每组20只。
1.2 手术方法
动物适应性喂养1周。手术前12 h禁食，自由饮水。采用体积分数0.10的水合氯醛（0.3 mL/100g体质量）腹腔注射麻醉。大鼠仰卧于手术台，常规消毒。依次切开皮肤、皮下组织、腹膜，腹壁用拉钩向两侧拉开，暴露肠系膜上动脉，在显微手术下用无损伤动脉夹夹闭系膜上动脉起始部。无菌生理盐水纱布覆盖切口，旁照灯照射保暖。1 h后松开动脉夹恢复肠系膜上动脉血流，依次关闭切口。对照组只进行同样操作但不夹闭肠系膜上动脉。正常组不手术。手术后大鼠予以分笼饲养。
1.3 标本处理及检测方法
术后6 h处死动物，三组同样进行肠系膜上动脉多聚甲醛灌注，取距回盲部15 cm处肠管1 cm，常规石蜡包埋，组织切片，苏木精伊红染色观察肠黏膜组织细胞学形态变化，用免疫组织化学方法检测MMP13及LN的表达情况。使用OLYMPAS BX50多功能显微镜，选取不同的视野观察并照相。运用显微图像分析系统（VIDAS）测定肠黏膜内免疫反应产物的含量。在每张切片上随机选出黏膜内的两个视野进行计算机显微图像分析，测得其平均吸光度（A），结果以±s表示，所得数据用SPSS 10.0统计学软件进行t检验。
2 结 果
2.1 苏木精伊红染色
实验组与对照组相比，肠壁变薄，上皮细胞水肿明显，部分坏死，小肠绒毛短细，绒毛间距变宽。可见中性粒细胞及淋巴细胞浸润，部分肠黏膜固有层内腺体灶性区域坏死。对照组与正常组差别不大。
2.2 LN免疫组化染色检测
实验组肠黏膜组织中,基底膜LN均出现不同程度的缺损、变薄，且时见中断或为间断线状、碎片状或完全缺如。对照组肠黏膜组织中，LN基本呈连续状，只有个别部分有轻度缺损。正常组肠黏膜组织中,LN位于被覆上皮细胞及腺体基底膜部,呈连续线状。半定量分析结果显示，三组的A值分别为0.290±0.067、 0.470±0.068、 0.500±0.068。实验组A值比对照组低，差异有显著性（t=3.31,P<0.01）。
2.3 MMP13免疫组化染色检测
三组肠黏膜组织中均有阳性细胞出现，其中实验组阳性细胞数量最多，染色最深；对照组介于实验组和正常组之间，染色较浅；正常组阳性细胞数量最少，染色最浅。半定量分析结果显示，三组的A值分别为0.290±0.025,0.160±0.025,0.150±0.025。实验组A值比对照组高，差异有显著性（t=3.46，P<0.01）。
3 讨 论
一般将肠屏障归纳为四部分：机械屏障，即黏膜上皮；生物屏障，即肠道内的常居菌群；化学屏障，即胃酸、胆汁、溶菌酶、黏多糖和蛋白分解酶等；免疫屏障。其中机械屏障尤其是小肠黏膜上皮细胞非常重要，它在充满细菌和毒素的肠腔和其他组织及血循环之间构建了一个物理性屏障，一般意义上的肠屏障即指这层结构[4]。其由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成，能有效阻止细菌穿透黏膜进入深部组织，肠道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是肠黏膜屏障的结构基础。 在应激状态下，肠屏障功能将发生一系列病理生理变化，肠缺血再灌注是应激状态中必经的病理生理过程[5]。本研究采用肠系膜上动脉夹闭松夹方法制备肠缺血再灌注模型。造模成功后取距回盲部15 cm处肠管1 cm作标本，结果显示肠壁变薄，上皮细胞水肿明显，部分坏死脱落，小肠绒毛短细，绒毛间距变宽，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，个别肠黏膜固有层内腺体灶性区域坏死。充分说明了肠黏膜缺血再灌注已经导致了肠黏膜屏障损伤，这与前人的研究也相吻合。
LN遭到破坏时，基底膜的完整性即被破坏，在肠黏膜表现为基底膜破坏、细胞间隙增大、通透性增加，使肠屏障受损，细菌、毒素移位，引发失控的炎症反应。本研究中，实验组肠黏膜组织基底膜LN均出现不同程度的缺损、变薄，且时见中断，或为间断线状或碎片状或完全缺如；对照组与正常组相比无明显差异。说明应激时肠黏膜缺血再灌注导致了LN的破坏，从而使肠黏膜屏障损害，通透性增加。
不同的MMPs对不同组分降解的特异性有所不同，其中MMP13对细胞外基质主要成分 Ⅳ 型胶原和LN的降解作用是基底膜丧失完整性主要原因[7]，这一点在我们的实验中也得到证实，MMP13表达越高，基底膜越不完整，甚至可见多处缺损或断裂现象。这种酶的变化最能反映出小肠黏膜基底膜及基质受损伤程度。MMP13表达增高，那么必然会导致其降解底物LN的分解增加，MMP13增加越多，LN就分解的越多，肠黏膜损伤也就越严重。
【参考文献】
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