1 研究对象
1.1 细胞株
购自上海细胞库的人宫颈癌细胞Hela , 人子宫颈鳞癌细胞Siha，人食管鳞癌细胞Eca109进行研究。
1.2 miR-101的mimics和inhibitor
miR-101的mimics和inhibitor由上海英骏生物技术有限公司设计并合成，并带有荧光标记。
同时还合成了mimics和inhibitor的阴性对照。
1.3 引物设计与合成
PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成
Real-time PCR引物探针序列如下表：
Primer Sequence5’→3’U6-F CTCGCTTCGGCAGCACAU6-R AACGCTTCACGAATTTGCGTmiRNAs通用Sense引物 GTGCAGGGTCCGAGGThsa-miR-101 TACAGTACTGTGATAACTGAAhsa-miR-101-RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTCAGThsa-miR-101-AS GCGTGCTACAGTACTGTGATAACTG1.4 主要试剂 DMEM 培养基: Gibico 公司，美国 胎牛血清（FCS）: Gibico 公司，美国 四甲基偶氮唑盐（MTT）：Invitrogen 公司，美国 胰蛋白酶酶：Gibico公司 LipofectamineTM2000：Invitrogen 公司，美国 Trizol: Invitrogen 公司，美国 PCR 产物纯化试剂盒：北京百泰克公司 DEPC: Amreseo 公司，美国 免疫组织化学一抗试剂盒： 兔抗人β-tubulin 多克隆抗体:SantaCruz 公司，美国 Opti-MEM: Invitrogen 公司，美国 RIPA裂解液：北京百泰克公司 primeScript TM one step RT-PCR kit: TaKaRa 宝生物工程有限公司，大连 EP管和离心管：Axygen公司，美国 SYBR Green PCR premix: TaKaRa 宝生物工程有限公司，大连 Rnase: Invitrogen 公司，美国 细胞凋亡试剂盒：Invitrogen公司，美国 DAB显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司 10×RT 缓冲液：epicentre公司 Taq DNA聚合酶：Takara公司 RNeasy Mini Kit: Qiagen公司 其他试剂，如：氯仿、异丙醇、无水乙醇、甲醛等均为国产分析纯。1.5 主要仪器 实时荧光定量PCR仪IQ5：BIO-rad 公司，美国 低温离心机：Sigma，美国 倒置显微镜：OLYMPUS 公司，日本 酶标仪：3550UV，BioRad公司，美国 干燥箱：202-2型，上海市实验仪器总厂 湿热灭菌器：MOU-313p,SANYO,日本 电热恒温箱：DNp9082，上海精密实验设备有限公司 超净工作台：上海依普监实验室设备有限公司 制冰机：SIM-F124 型，SANYO公司，日本 精密电子天平：Sartorius 公司，德国 超纯水装置：Milli-Qplus 型，Millipore 公司，美国 微量核酸蛋白检测仪：Nanodrop1000, Thermo Scientific,美国 台式低速离心机：TD5A-WS，上海湘仪离心机仪器有限公司 干热灭菌器：MOV-313P，SANYO 公司，日本 微型离心机:Mini-41c，珠海黑马医学仪器有限公司 紫外分析装置：FR-110，上海夏日科技有限公司 立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-3011，上海博迅实业有限公司医疗设备厂 微量加样器：Eppendorf 公司，德国 电子天平：赛多利斯公司，美国 恒温水槽：NTT-2100，TOKYORIKAKIKAI，日本 高速离心机：5810R、5415D，Eppendorf 公司 研磨仪：MM301，Retsch2 内容与方法2.1 细胞培养2.11 复苏细胞及培养 将冻存于液氮罐内的Hela , Siha , Eca109 细胞冻存管从布袋里取出，迅速放入37℃左右的水浴锅中快速晃动，该过程中应注意冻存管的顶部要保持在水面以上，以防冻存管忽然遇热裂开污染细胞。当摇晃至管内的冻存液完全融化后，用含70%乙醇的棉球轻轻擦拭冻存管消毒，放入超净台中。用移液管将冻存管中的液体移入15ml的离心管中，加入8ml左右的培养液，拿另一只15ml离心管与之配平，放入离心机中，1000rpm 离心5min，弃去上清液，再加入培养液，同上一步，再离心一次，目的是将残存的冻存液洗干净，以防影响细胞的生长。5min的离心后，弃上清液，加入6ml的已配好的培养液（Hela 和Eca109细胞的培养液是含10%胎牛血清的DMEM，Siha 细胞的培养液是含10%胎牛血清的1640），吹打沉在管底的细胞均匀的分布在培养液中，然后用移液管将6ml的液体移入培养瓶中，置于37℃, 5 %CO2 饱和湿度的细胞培养箱中进行培养。24小时后换液观察细胞的生长状况。2.1.2 细胞传代 在倒置显微镜中观察细胞的生长状况，当细胞生长密度到达80%以上时可进行细胞传代。弃去培养瓶中的培养液，加入3ml左右的37℃预热好的PBS缓冲液洗涤细胞一次，向瓶中加入10滴左右37℃预热好的0.25%胰蛋白酶溶液，将其均匀的分布于瓶底，与细胞充分接触，然后上下轻轻摇晃培养瓶底，可看见有细沙一样的透明物质脱落，倒置显微镜下观察可见贴壁细胞收缩，形状从多角形慢慢变成圆形，细胞的间隙变大后，立即加入各细胞所适合的含10%胎牛血清的培养液，以此终止胰蛋白酶的消化作用。然后，用吸管反复吹打瓶底，使贴壁细胞完全从壁上脱下，悬浮于培养液中，然后记数一次，按照记数结果计算出传代的瓶数。将培养瓶中的悬浮细胞平均分配与各培养瓶中，补足培养液至每瓶5-6ml，置于37℃, 5 % CO2 饱和湿度的细胞培养箱中继续培养。2.1.3 细胞冻存 取对数生长期的细胞，弃去培养液，用0.25% 的胰蛋白酶消化3-5min后，加入含10%胎牛血清培养液，用吸管反复吹打贴壁细胞，将细胞悬浮液收集到15ml离心管中，1000rpm离心5 min, 弃去胰蛋白酶及培养液，加入配好的冻存液（5ml的培养基，4ml的胎牛血清，1ml的DMSO，混匀抽滤），用吸管轻轻反复吹打细胞使其形成单细胞悬液，均匀分装至无菌的冻存管中，每管冻存细胞悬液约1.5ml左右，约3×106个细胞，用封口膜将其密封，放置于4 ℃冰箱内30min，再放置于-20℃冰箱中30min，移至-80℃冰箱内过夜，次日早上转移至液氮罐中保存。2.1.4 细胞接种 取对数生长期细胞，在转染前一天用PBS缓冲液洗涤细胞，0.25%胰蛋白酶消化使培养液内细胞呈悬浮状态，记数后，按照每孔约3×104个细胞的密度将细胞悬液接种于24孔细胞培养板中，然后每孔加入500ml的培养液，置于37℃, 5 % CO2 饱和湿度的细胞培养箱中培养，24h小时后观察细胞，当细胞生长密度达到80%-90%的融合面积时，准备进行转染。实验分为4组，空白对照组，阴性对照组，上调实验组和下调实验组，每组设3个复孔。2.1.5 细胞计数 将胰蛋白酶消化并终止后的悬浮液用枪头取出54ul滴在塑料膜上，加入6ul的台盼蓝染色，混匀，取10ul悬液滴在计数板上，放在倒置显微镜下计数。数出计数板四个大格中的细胞数（按照数左不数右，数上不数下，如果有三四个细胞聚在一起，按一个细胞进行计数的原则），套入计数公式中，即可得到细胞的计数结果。2.2 细胞转染步骤2.2.1 转染前准备 转染前一天，每孔板的细胞弃去培养液，加入500ul的OPti-MEM，这样可以使细胞处于同步的饥饿状态。2.2.2 稀释siRNA 用50ul DEPC 水重悬1OD的siRNA（mimics/ inhibitor 以及阴性对照的siRNA）,震荡混匀溶解。2.2.3 制备siRNA- lipofectamine2000 复合物 (1)稀释1ul microRNA-101的mimics/ inhibitor于50ul OPti-MEM中，混匀。 (2) 摇匀lipofectamine2000, 然后稀释1ul于50ul OPti-MEM中，混匀，孵化5 min。 (3) 将稀释后的mimics/ inhibitor和lipofectamine2000混匀，放置20min。2.2.4 细胞转染 （1）将siRNA- lipofectamine2000 复合物每培养瓶加入10ul, 24孔细胞培养板每孔加入1ul, 96孔细胞培养板每孔加入0.5ul， （2）每培养瓶补加1000ul OPti-MEM，24孔细胞培养板每孔加入200ul OPti-MEM , 96孔细胞培养板每孔加入45ul OPti-MEM，正常组不用加siRNA- lipofectamine2000 复合物，直接加OPti-MEM即可。 （3）24小时后弃去原来的培养液，换成含10%胎牛血清的培养液。 （4）在倒置显微镜下避光拍照，观察转染效率。2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR, qRT –PCR）2.3.1 实验前准备 导致RNA降解的最主要的物质是RNA酶,它的生物活性稳定并且可以广泛分布在灰尘中、各种实验器皿上、实验试剂中以及人体分泌的汗液唾液中。因此在进行提取RNA进行RNA分析技术的过程中最关键的因素是尽量减少RNA酶的污染,控制其对RNA的降解作用,实验过程中应该采取以下措施: （1）实验室环境要洁净:操作实验人员必须带一次性手套、口罩 ,采用70%乙醇仔细擦拭移液器的内部和外部。 （2）Eppendorf管和枪头等采用一次性RNase-free的塑料制品。玻 璃和金属物品要事先进行高压灭菌160℃，2h。处理3Oh两次即可使用" （3）溶液配置: 配置的各种溶液应加入0.1%DEPC在37℃处理12-16h,然后高 压去除残留的DEPC。不能高压灭菌的溶液,可以用DEPC处理过的无RNA酶的去离子水来配置所需溶液,然后用0.22um滤膜过滤除菌。2.3.1 细胞总RNA的提取 （1）弃培养瓶中的培养基，用冷的PBS缓冲液轻轻冲洗2次，加入1000ul trizol，反复吹打至细胞脱壁并且融于trizol中。 （2）将吹打完的悬浮液移入1.5ml 离心管中，用移液枪吹打40下至完全混匀，冰上放置5 min。 （3）加入200ul氯仿至上述离心管中，剧烈震荡15s-30s，室温放置3-5min后4℃ 12000rpm 离心15min。 （4）这时离心完的液体已经分层，调50ul的移液枪慢慢轻轻吸取上清液至另个一1.5ml无菌离心管中并做好标记，大概移400ul左右。 （5）加入400ul 异丙醇，用力震荡摇匀，-20℃放置30min 后4℃ 12000rpm 离心10min。 （6）弃去上清，在离心管底部可以看见少许白色沉淀，即为RNA 样品，然后用70%乙醇1000ul漂洗一次，4℃ 7500 rpm 离心5min，弃去上清，剩下的液体拿1ul小枪慢慢将其洗干净，在通风橱室温晾干。 （7）晾干后每个样品中加入20ul-30ul的DEPC水，轻轻吹打待RNA 样品溶解后，每个样品取2ul进行RNA定量检测 OD 260/280吸光度的比值，样品比值＞1.8为合格。2.3.2 注意事项: （1）在细胞样品中加入Trizol后,若发现液体粘稠,吹打后能牵起丝状物,说明 Trizol的量太少,可以再补加Trizol。 （2）加入Trizol后要尽量让其与贴壁细胞充分接触后再吹打，注意温度的控制，尽量保持在冰上进行，以免RNA降解。2.3.3 逆转录反应合成cDNA2.3.4 实时荧光定量PCR实验2.4 MTT法2.4.1 细胞接种 将处于对数生长期的Hela, Siha, Eca109细胞以每孔103-104个细胞均匀的接种于96孔细胞培养板中，每孔体积200ul, 四周边缘用无菌PBS 填充。 2.4.2 24小时后观察细胞的生长状况，当长到80%-90%左右时制备RNA- lipofectamine2000 复合物 （1）阴性对照组和上调实验组，下调实验组按每孔分别用0.5ul的阴性siRNA ,0.5ul mimics, 0.5ul inhibitor加入25ul OPti-MEM的量加入至离心管中, 正常实验组直接加25ul OPti-MEM。 （2）阴性对照组和上调实验组，下调实验组按每孔分别用0.5ul lipofectamine2000 加入25ul OPti-MEM的量加入至离心管中。 （3）室温孵育5min。 （4）将各组siRNA稀释物分别和ipofectamine2000稀释物均匀混合，室温孵育20min。 （5）将RNA- lipofectamine2000 复合物以每孔30ul均匀滴入各组转染孔再各加入170ul无血清无抗生素的培养液，24小时后弃去原来的培养液换成含10%胎牛血清的培养液放入细胞培养箱继续培养。 （6）分别在培养0h, 24h, 48h, 72h 后，将5×MTT用稀释液稀释成1×MTT溶液，待测孔每孔加入MTT稀释液50ul，37℃继续孵育4h后弃去孔内的上清液，每孔加入150ul DMSO，震荡10min 使其变成的紫色结晶物质充分的溶解。 （7）在490nm 波长下用酶标仪测定各孔吸光度值，记录结果，绘制生长曲线并计算细胞的生长抑制率。2.4.3 注意事项 (1) 应选择适当的细胞接种浓度和培养时间，浓度不易过多，细胞代数不易超过2代。 （2）设置调零孔（只加培养基100ul、MTT10ul、二甲基亚砜100ul）。 （3） 设置空白孔（细胞、药物溶解介质、培养液共100ul、10ulMTT 、100ul二甲基亚砜）。 （4） 96孔板边缘32孔用无菌PBS填充，因为边缘的32孔中水分蒸发很快，药物易被浓缩，对实验影响大。同时加入PBS液填充后，可以一定程度上保持中间孔的水分。 （5）培养过程中48h应该换液一次，因为100ul的培养液对于104-105次方的增殖期细胞来说，很难维持50h以上，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响实验结果。 （6） 避免血清干扰。高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。 （7）判断污染。如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性极大。在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。 （8）MTT有致癌性，使用时要小心。2.5 细胞凋亡2.5.1 步骤（1） 取对数生长期细胞，进行转染（转染步骤如上所述） （2）24小时后，将阴性对照组，正常组，上调实验组，下调实验组中培养瓶里的细胞消化下来，1000rpm 离心5min，弃去上清液，加入PBS后再次离心，之后将细胞收集于1.5ml的离心管中。 （3）将所收集的细胞加入1×binding buffer 100ul 重悬再分别加入2ul的PI和5ul的Annexin V 染色，避光置于冰上15min，再加入1×binding buffer 400ul，在30min内上流式细胞仪检测凋亡率。2.5.2 注意事项： （1）必须用活细胞进行检测，不能用能破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。 (2）特殊细胞的染色方法：在消化或吹打时，有些细胞（如神经元细胞）很容易受到损伤，导致晚期凋亡或坏死比例非常高，不能反映真实结果。实验的解决方法可以先低速离心，吸取细胞培养板中的液体，留少许液体，加入适量PI和Annexin-V染色10min后，将漂浮细胞吸至离心管中，离心洗涤两次，用PBS漂洗贴壁细胞两次，加胰酶消化后将细胞悬液移至另一离心管中，离心洗涤，再与漂浮细胞合并后上流式细胞仪检测。应用该法可降低晚期凋亡和坏死比例，增加早期凋亡细胞比例。 （3）由于Annexin-V为钙离子依赖的磷脂结合蛋白，只有在钙离子存在的情况下与PS的亲和力才大，因而在消化细胞时，建议一般不采用含EDTA的消化液。 （4）必须设置阴性对照和补偿对照（分别转染）。2.6 划痕实验 （1）取对数生长期的细胞，以3×104个细胞每孔的细胞悬液均匀接种于24孔细胞培养板，置于37℃，5%CO2孵育箱内孵育。 （2）24h 后观察细胞生长状态并进行转染，实验分组同前，每组设三个复孔。 （3）观察24孔细胞培养板中细胞的生长密度，直到到达80%-90%融合。 （4）弃培养液后用10ul无菌枪头在每孔底部画一条直线，确保每孔直线的粗细均等并保持划线的力度，以免带下大片细胞。 （5）PBS洗涤一次，加入新的培养液。 （6）倒置显微镜下观察划痕宽度及细胞密度比较一致的部分做标记，分别在第一天，第二天，第三天同一时间进行拍照测量划痕宽度并观察划痕的愈合速度。 2.7 免疫组化 （1）取对数生长期的细胞，以3×104个细胞每孔的细胞悬液均匀接种于24孔细胞培养板，置于37℃，5%CO2孵育箱内孵育。 （2）24h 后观察细胞生长状态并进行转染，实验分组同前，每组设三个复孔。 （3）转染24小时后，每孔用PBS漂洗2次，每次2min （4）4%多聚甲醛处理（室温）20min。 （5）PBS再次漂洗3次，每次2min。 （6）3% H2O2处理细胞15min。 （7）PBS再次漂洗3次，每次2min。然后加入血清封闭液每孔5滴，37℃，20min。 （8）将一抗用PBS按1：100稀释，每孔加入一抗50ul，阴性对照孔用PBS代替一抗。然后4℃冰箱内过夜。 （9）第二天从冰箱中拿出24孔细胞培养板，PBS漂洗3次，每次2min。 （10）二抗（COX-2或EZH2）孵育，37℃，20min。 （11）PBS漂洗3次，每次2min （12）DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂按500ul 蒸馏水中各加4ul，混匀，在镜下观察显色情况，在没有背景的条件下可继续显色，一般在2-10min。 （13）PBS 冲洗，拍照，计数阳性率。