matK和rbcL序列在半夏属中的应用3100字
matK和rbcL序列在半夏属中的应用3100字 半夏是一味传统的中药材，广布于长江流域，在华北、东北等地也有分布。临床上多用于治疗痰多咳喘，痰饮眩悸，风痰眩晕，痰厥头痛，呕吐反胃等[1-2]。
半夏属（Pinellia）是天南星科（Araceae）一个重要的属，该属共9种，其中7 种为中国特有[3]。该属被认为是天南星科的一个进化类群[4]。近年来用很多方 法对该属以及其他物种的种间亲缘关系进行了研究[5-8]。matK序列是植物叶绿 体trnK基因的内含子中的一个开放阅读框,功能与RNA转录体中Ⅱ型内含子的剪 切有关，进化速率较快，在科、属级水平能提供较多的进化和系统发育信息[9]。
rbcL基因编码核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenas）大亚基，其序列高度保守[10]，郑思浩等[11]研究 matK+rbcL联合序列能够鉴别半夏及其混伪品，但对matK序列和rbcL序列在半夏 属的应用尚未见报道。本研究拟利用matK+rbcL联合序列分析半夏属植物的系统 发育亲缘关系，在一定程度上为半夏药材及其近缘种的种间分子鉴定提供参考依 据。
1 材料和方法 1.1 材料来源 部分半夏样品采自陕西商洛，部分来自genbank下载，其余物种的matK序列 和rbcL序列均从genbank下载。经比对剪切后共21条序列，见表1。
1.2 DNA提取、PCR扩增及序列测定 1.2.1 半夏总基因组DNA提取 2015年5~6月份，半夏植物生长盛期内，在商洛学院校园及二龙山采集其新 鲜叶片，迅速用硅胶干燥，保存备用。实验室中采用改良CTAB 法[12]提取基因 组总DNA后，溶解于少TE溶液中。-20 ℃保存备用。
1.2.2 matK和rbcL序列扩增及测序 参考赵月梅等[13]中的matK序列和rbcL序列的所用的PCR引物、扩增条件及 扩增体系。扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送往上海生物工程有 限公司进行测序。1.3 数据处理 用ClustalX 2.0对测序获得的半夏的matK序列进行查看和比对。同时，在 GenBank数据库中下载其同属植物闽半夏、盾叶半夏、大叶半夏、心叶半夏、掌 叶半夏及三裂半夏的matK序列和rbcL序列，共21条用于后续分析。用MEGA5.0计 算种间遗传距离，并用matK序列和rbcL序列及二者联合matK+rbcL序列分别构建 NJ树分析各物种之间的关系。
2 结果与分析 2.1 种内、种间序列比对分析 将半夏属半夏等7种植物的matK序列及rbcL序列测序或下载获得的序列进行 查看和比对后，组成二者联合序列（表2），其中matK序列比对后总长度为418 bp， 无插入缺失序列。其中变异位点20个（4.78%），T、C、A、G的含量分别为36.9%、 16.8%、29.3%、17.0%；
rbcL序列比对后的长度为638 bp，无插入缺失序列，变 异位点12个（1.88%），T、C、A、G的含量分别为28.1%、20.7%、28.4%、22.9%。
二者相比，matK序列变异较大。二者的变异多位于种间，种内变异较少。
2.2 半夏及其伪品的K2P遗传距离分析 表3及图1均显示了matK序列在种内及种间的K2P距离分布。由表3可知：种间 距离最大的为心叶半夏和闽半夏之间，为0.019，种间距离最小为半夏与盾叶半 夏之间，盾叶半夏与大叶半夏之间，均为0.001。值得注意的是，闽半夏与其余6 个种之间的遗传距离均较大，表明该物种与半夏属其他物种之间亲缘关系较远。
2.3 聚类分析 由matK序列构建的系统发育树只有掌叶半夏，大叶半夏和三裂叶半夏的几个 个体各自聚成了一支；
同理，由于rbcL序列构建的系统发育树只有半夏、掌叶半 夏、三裂叶半夏三个物种的个体能聚在一起。由matK+rbcL联合片段构建的系统 发育树（图1）可知：半夏属这7种植物均能独立聚为一支。半夏的7个个体聚在 了一起，支持率为65，盾叶半夏与半夏亲缘关系较近，聚在一起，支持率为78。
掌叶半夏6个个体聚在一起，支持率为90，三裂叶半夏3个个体聚在了一起，支持 率为55，闽半夏与其他种之间亲缘关系较远，最先形成一个独立的枝，支持率为89。
3 结论与讨论 本文用matK和rbcL联合序列分析了半夏（Pinellia ternata）及其同属物种 共7个种，包括序列特征、种间遗传距离及种间的亲缘关系。从实验方法上来看， 采集自商洛市的半夏植物的matK序列和rbcL序列的PCR反应条件及通用引物应用 情况均表现良好，且在采样不足的情况下，在genbank中也有丰富的序列信息可 供参考。欧阳钟鸣等[6]研究了掌叶半夏与盾叶半夏、心叶半夏、半夏和石蜘蛛 等4个种呈姐妹类群，张乐荣等[8]研究了滴水珠与盾叶半夏聚在一起，石蜘蛛， 半夏亲缘关系较近，虎掌与上述几个物种距离较远，形成一个独立的枝。由于这 几个研究中所涉及的物种种类和分子标记都不同，因此在进化树的结果上存在较 大差异。本文用matK与rbcL联合数据分析半夏属7个物种的亲缘关系发现：闽半 夏与其余6个物种之间亲缘关系最远，半夏与盾叶半夏亲缘关系较近，由于缺乏 石蜘蛛和虎掌等物种的数据，因此无法判断这两个物种与这7个物种之间的关系。
本研究结论能将这7个物种各自聚类，对于半夏属种内之间的物种鉴定有参考意 义，但要探讨本属的所有物种之间的亲缘关系，则需要联合更多的基因片段才能 提供的足够的变异信息来进行系统分化分析。
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