【摘要】 目的 探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用。方法 采用MTT法检测低剂量顺铂节律化疗对人脐静脉内皮细胞HUVECs、人肝癌细胞株HepG2增殖的影响;采用流式细胞术检测细胞周期观察其对HUVECs、HepG2生长的影响；采用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型,观察其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果 低剂量顺铂（7.5～750.0 μg/L）持续作用24、48、72 h,对HUVECs具有抑制增殖作用，且在7.5 ～750.0 μg/L 范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组,差异有显著意义(F=14.57～285.44，q=3.50～7.63，P<0.05),且当顺铂浓度达到750.0 μg/L时对内皮细胞HUVECs增殖抑制作用达到饱和。相同条件下,低剂量顺铂对人肝癌细胞株HepG2则未显示出抑制作用,实验组的吸光度值与对照组比较差异无显著意义(F=0.71～1.18，P>0.05)。流式细胞仪检测显示低剂量顺铂组处理HUVECs 细胞48 h 后与对照组比较,随顺铂浓度增大，G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增多,其差异有显著性（F=6.44～12.30,q=3.26～8.47,P<0.05）；低剂量顺铂组处理HepG2细胞48 h后与对照组比较,各期细胞比例无明显改变，差异无显著意义(F=0.03～0.10，P>0.05)。低剂量顺铂持续作用对鸡胚尿囊膜的血管发生具有显著影响,低剂量顺铂组抑制百分率为（30.0±5.0）%～（50.0±5.0）%，与生理盐水对照组比较差异有显著性(F=259.04,q=7.76～38.80,P<0.05)。结论 低剂量顺铂节律化疗体外有抑制血管内皮细胞生长、体内有抑制血管生成作用。
【关键词】 顺铂；药物疗法；新生血管化,病理性；绒毛尿囊膜
20世纪70年代初,FOLKMAN[1]提出通过抑制肿瘤新生血管的生成来抑制肿瘤的生长,为肿瘤的治疗开辟了新的思路。近几年研究显示，持续或高频率给予比最大耐受剂量(MTD)小得多的单次剂量更有效,不仅能降低毒性反应,而且能提高抗肿瘤效果[2]。此外,这种方案适合与靶向药物及毒性相对低的抗癌药物合用。最新的定义将此称为“节律化疗”,即高频率甚至每天1次给予比MTD低得多的化疗药物,且不伴较长的间歇期。顺铂为一含铂无机络合物，抗瘤谱广、疗效高，具有与多种抗癌药协同作用的优点，是常用的化疗药物，但其毒副作用较大，大剂量、多疗程应用可引起体质量下降及肝脏、肾脏毒性等，并可成为不可逆损伤，其是否有抗血管形成作用目前国内外少见报道。本研究探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用, 为临床上应用低剂量顺铂抗肿瘤血管生成治疗提供实验依据。现将结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株及细胞培养 人脐静脉内皮细胞(HUVECs) 由美国Sciencecell公司生产，使用含体积分数0.10 FBS、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的ECM条件培养基常规培养,第4～6代细胞用于实验。HepG2细胞系本实验室常规培养，使用含体积分数0.10 FBS、100 kU/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基常规培养。受精White Leghorn 6日龄鸡胚(青岛群兴种禽有限公司),白色,37.5～38.0 ℃,湿度为60%～80%,恒温全自动孵化设备孵育。
1.1.2 主要试剂 ECM培养基由美国Sciencecell公司生产；DMEM培养基和胎牛血清(FBS)由兰州民海生物工程公司生产; 注射用冻干型顺铂，购自齐鲁制药有限公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)、 甲基纤维素系Sigma公司产品；二甲基亚砜(DMSO)由武汉博士德生物工程有限公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞增殖抑制试验(MTT法)[3] 收集对数生长期的HUVECs及HepG2细胞，以0.5×104/mL分别接种于96孔培养板,于37 ℃、含体积分数0.05 的CO2饱和湿度培养箱中培养,24 h后换入顺铂浓度分别为 7.5、75.0、750.0、7 500.0 μg/L含药培养液,对照组用不含药物的培养液换液,然后移至37 ℃恒温、含体积分数0.05 的CO2饱和湿度培养箱中继续培养，24、48、72 h后各取出一块培养板,每孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续培养4 h后,取出96 孔培养板，1 000 r/min离心5 min后,弃孔内培养液。每孔加入150 μL的DMSO,振荡10 min,酶标仪测定570 nm波长处的吸光度值(A值),细胞存活率=药物实验组A值/细胞对照组A值×100%。
1.2.2 细胞周期分析 收集对数生长期HepG2细胞及HUVECs,以1×109/L细胞浓度10 mL接种于100 mL培养瓶中,孵育24 h。按实验分组分别加入相应药物,继续培养48 h 后取出各组细胞一瓶,离心,预冷PBS (pH 7.40) 洗2次。将经PBS 洗后的细胞悬液快速注入装有预冷1 mL含体积分数0.75乙醇的EP 管中,混匀,4 ℃冰箱过夜。PBS洗2次,将等体积的细胞悬液和碘化丙啶(PI)染液混合,4 ℃放置30 min。混合液过300目尼龙网以除去杂质。将样品放入流式细胞仪测定,所得数据输入Macintish 650型计算机,分析细胞周期分布。
1.2.3 鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)体内血管生长试验[4] 将鸡受精卵在37 ℃、60%相对湿度恒温箱中孵育至血管生长高峰时(第7天)，在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区域（约胚头右下方0.5～1.0 cm处)，划定1 cm×1 cm开窗位置，在鸡胚气室端钻1 mm小孔并穿透壳膜。在蛋壳开窗位置用小砂轮磨切开窗，体积分数0.75乙醇消毒，用橡皮吸头从气室小孔轻轻吸气使绒毛膜下沉，用手术剪轻轻揭去蛋壳及壳膜，暴露出鸡胚尿囊膜。将甲基纤维素薄片放置于尿囊膜毛细血管新生区,用微量进样器将不同浓度的顺铂20 μL滴入纤维素薄片上。对照组用生理盐水，滴入量同顺铂组，用消毒薄膜封窗后放人孵化箱，继续孵化。每天追加相同剂量的药物,72 h后揭去消毒薄膜，加入适当甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15 min。待绒毛尿囊膜血管中的血液凝固后,将薄片周围3 cm直径区域内的尿囊膜剪下,光学显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况,计算其抑制百分率。
1.3 统计学处理
实验数据采用SPSS 13.0 与PPMS 1.5[5]统计软件进行处理,统计方法采用方差分析。
2 结果
2.1 低剂量顺铂节律化疗对HUVECs和HepG2细胞的抑制作用
低剂量顺铂作用HUVECs细胞24、48、72 h,结果显示均具有抑制作用,且在一定的范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组,差异有显著性(F=14.57～285.44，q=3.50～7.63，P<0.05),当顺铂浓度达到750.0 μg/L时对内皮细胞增殖抑制作用达到饱和。相同条件下,低剂量顺铂对人HepG2细胞则未显示出抑制作用,低剂量顺铂组的吸光度值与对照组比较差异无统计学意义(F=0.71～1.18，P>0.05)。见表1。
2.2 流式细胞仪检测细胞周期变化
低剂量顺铂组处理HUVECs 细胞48 h 后,随顺铂浓度增大,G0/G1期细胞比例与对照组比较明显减少,差异有显著性（F=12.30,q=3.20～8.47,P<0.05）；S期细胞比例明显增多,差异有显著性（F=6.44,q=3.18～6.04,P<0.05）；G2/M期细胞比例变化不明显，差异无统计学意义（F=0.16,P>0.05），且当顺铂浓度达到750.0 μg /L时作用达到饱和。低剂量顺铂组处理HepG2细胞48 h后与对照组比较,各期细胞比例无明显改变，差异无统计学意义(F=0.03～0.10，P>0.05)。见表2。
表1 不同浓度低剂量顺铂对HUVECs和HepG2细胞存活率的影响（略）
表2 不同浓度低剂量顺铂作用HUVECs和HepG2细胞 48 h细胞周期分布（略）
2.3 低剂量顺铂对CAM血管形成的影响
本文实验结果显示，低剂量顺铂节律化疗具有抑制CAM新生血管形成的作用。低剂量顺铂组与生理盐水对照组各取10个受精鸡胚，按上述方法分别加入不同浓度的顺铂及生理盐水，其抑制百分率分别为：顺铂7.5 μg/L组为（30.0±5.0）%，顺铂75.0 μg/L组为（40.0±4.0）%，顺铂750.0 μg/L组为（50.0±5.0）%，顺铂7 500.0 μg/L组为（50.0±4.0）%，生理盐水对照组为0%，低剂量顺铂组与生理盐水对照组比较有显著性差异(F=259.04,q=7.76～38.80,P<0.05)，且当顺铂浓度达到750.0 μg/L时作用达到饱和。
3 讨论
抗血管治疗作为抗肿瘤治疗研究的热点,仅有少数几种药物，如endostatin、TNP470批准进入临床应用。近年来,国外研究发现，不少传统的细胞毒药物在低剂量(非细胞毒浓度)下表现出了抗血管生成的活性，这种新的化疗方式重新定义了治疗的作用靶位不是肿瘤细胞而是新生的血管内皮细胞。MILLER等[6]将此方法称为“抗血管生成方案”,并提出“重新确定化疗靶向” 的观点。有研究报道,50%的新生血管内皮细胞来自骨髓衍生的循环内皮祖细胞(CEPs),CEPs可以通过血管内皮生长因子(VEGF)从骨髓进入外周血循环,在那里它们迁移到血管生成区并分化成成熟的内皮细胞，抗血管生成化疗阻止血管修复的部分原因就在于化疗对CEPs的作用[7]。目前许多观点支持这一疗法，包括频率越高越好及剂量越小越好，在短间隔(如每2周1次)内给与一种或多种化疗药物的 “剂量密度”疗法已在Ⅲ期随机临床试验中显示出良好效果[8],其给药观念在某些方面与节律化疗相似；一些学者通过数学模型对这种给药模式进行研究分析发现，机体可通过抑制肿瘤新生血管生长，产生持久的抑瘤效果，比常规的最大耐受剂量化疗可能会更加延长病人的生存时间[9]；DKLEMENT 等[10]的实验显示，活性增殖的内皮细胞较增殖的肿瘤细胞对化疗药物更敏感。低浓度的化疗药物长期持续使用，避免了常规化疗方案中内皮细胞在化疗间歇期的恢复，增加其抗血管生成效果，起到长期抑制肿瘤的作用[11]。低剂量节律化疗的优点为：①内皮细胞遗传性状稳定，不易产生耐药；②所需剂量小，无明显毒副作用；③血管靶向治疗不依赖实体瘤类型而异，抑瘤谱广；④药物易于到达靶细胞，具有高效性；⑤能与特异性抗血管生成药物合用，提高疗效[12]。因此，研究传统化疗药物的抗血管生成作用不仅具有重要的理论意义,同时也具有临床实际应用价值。 顺铂是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，它通过与DNA链结合，抑制DNA、RNA合成和细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤生长，该药已用于多种实体肿瘤的治疗，是目前较为有效的化疗药物之一。本实验分别挑选了体内、体外两种典型的实验方法探讨低剂量顺铂持续应用对血管形成的影响。实验结果表明，低剂量顺铂持续应用在体外可以抑制人血管内皮细胞的增殖,在体内可以抑制鸡胚尿囊膜血管的新生，抑制作用在7.5～750.0 μg/L 的浓度下呈剂量依赖性,当顺铂浓度达到750.0 μg/L时作用达到饱和。同时,在实验所选定的浓度下,低剂量顺铂在体外未能抑制肿瘤细胞的增殖。提示低剂量顺铂持续应用对新生肿瘤血管的抑制机制与其细胞毒作用不同,是在非细胞毒浓度下表现出的特殊能力,是抗癌机制的一个重要方面。
总之，低剂量节律化疗抗血管生成作用是近来提出的新观点，其前期临床试验具有可行性优势，但目前仍有许多挑战需要克服以提高临床用药的成功率。随着研究的深入，低剂量节律化疗有望成为晚期肿瘤姑息治疗的一种新选择，通过提高病人的生活质量，使之长期带瘤生存，使那些不易治愈的肿瘤成为可控性疾病。
【参考文献】
[1]FOLKMAN J. Angiogenesis and apoptosis[J]. Semin Cancer Biol, 2003,13(2):159167.
[2]HANAHAN D, BERGERS G, BERGSLAND E. Less is more, regularly:metronomic dosing of cytotoxic drugs can target tumor angiogenesis in mice[J]. J Clin Invest, 2000,105(8):10451047.
[3]PICCARTGEBHARTM J. Mathematics and oncology: a match for life[J]? J Clin Oncol, 2003,21(8):14251428.
[4]BERTOLINI F, PAUL S, MANCUSO P, et al. Maximum tolerable dose and lowdose metronomic chemotherapy have opposite effects on the mobilization and viability of circulating endothelial progenitor cells[J]. Cancer Res, 2003,63(5):43424346.
[6]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.
[6]HAHNFELDT P, FOLKMAN J, HLATKY L. Minimizing longterm tumor burden: the logic for metronomic chemotherapeutic dosing and its antiangiogenic basis[J]. Theor Biol, 2003,220(4): 545554.
[7]MILLER K D, SWEENEY C J, SLEDGE G W. Redefining the target:chemotherapeutics as antiangiogenics[J]. J Clin Oncol, 2001,19(4):11951206.
[8]KLEMENT G, HUANG P, MAYER B, et al. Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an antiVEGFR2 antibody in multidrugresistant human breast cancer xenografts [J]. Clin Cancer Res, 2002,8(1)：221232.
[9]NGUYEN M, SHING Y, FOLKMAN J. Quantitation of angiogenesis and antiangiogenesis in the chick embryo chorioallantoic membrane[J]. Microvasc Res, 1994,47:3140.
[10]MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival: application to proferation and cytotoxicity assays[J]. J Immunol Methods, 1983,65:5563.
[11]王延涛,沈方臻,侯继院. 低剂量顺铂并IFNα对小鼠移植性肝癌血管生成影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1):37.
[12]侯继院,沈方臻,王延涛,等. 顺铂低剂量节律化疗抑制小鼠H22肝癌血管生成观察[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(2):95.