【关键词】 蛋白
Role of HCV core protein in yeast twohybrid system in reporter gene expression and activation
【Abstract】 AIM: To construct the bait vector of HCV core protein in yeast twohybrid system and then to study its effect on the growth of yeast cells and the activation of reporter genes. METHODS: cDNA fragments encoding HCV core region were amplified by PCR and subsequently cloned into pUC19. After verified by sequencing, they were subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast twohybrid system. These recombinant plasmids were transferred into AH109 and they activated the reporter genes. RESULTS: The fragments of HCV core protein were successfully obtained, which were not toxic to AH109 but could not activate the reporter genes. CONCLUSION: Yeast twohybrid GAL4 system 3 can be utilized to fish HCV core regioninteracting protein. HCV core protein does not have selfactivating function.
【Keywords】 hepatitis C virus core protein; yeast twohybrid system; reporter gene
【摘要】 目的： 检测用含丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的cDNA片段构建的酵母双杂交诱饵载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用. 方法： PCR扩增含HCV核心蛋白不同大小的cDNA片段，分别克隆入pUC19质粒，经测序正确后，再分别亚克隆入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中. 将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用. 结果： 成功获得含HCV核心蛋白的cDNA片段，HCV核心蛋白对酵母菌AH109无毒性，且对报告基因无激活作用. 结论： 利用酵母双杂交Gal4系统3研究与HCV核心蛋白相互作用的蛋白,证实了HCV核心蛋白无自激活功能.
【关键词】 HCV核心蛋白；酵母双杂交；报告基因
0引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)核心蛋白位于病毒多肽的氨基末端，被宿主的信号肽酶切割后产生. HCV核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有调节细胞凋亡、脂代谢、转录、免疫呈递等作用［1］,其氨基酸序列高度保守，临床和实验研究显示HCV 核心蛋白具有广泛的反式激活作用［2-3］，与宿主蛋白相互作用，可能是病毒感染导致肝细胞损伤和肝细胞癌发生、发展的重要原因. 酵母双杂交系统是一种分析真核细胞中蛋白蛋白、蛋白DNA、蛋白RNA相互作用的基因分析方法. 蛋白质与蛋白质的相互作用是很多生命现象的基础［4］. 酵母双杂交Gal4系统3是在系统1和系统2基础上的改进，具有转化效率高，假阳性率低等优点. 我们利用它来克隆与HCV核心蛋白相互作用蛋白的基因，以期为HCV 核心蛋白功能的研究提供新依据.
1材料和方法
1.1材料
克隆有HCV全长cDNA的质粒pCDNA3.0HCV由第四军医大学微生物学教研室尹文博士惠赠；表达载体pGBKT7，AH109酵母菌种（美国Clontech公司）；质粒pUC19菌种（本研究室保存）；PCR试剂盒、DNA重组所用的各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶（Gibco公司）；DNA电泳胶回收试剂盒（上海华舜生物工程公司）；酵母培养试剂（美国Clontech公司）.
1.2方法
1.2.1PCR扩增克隆编码核心蛋白的引物为①引物P1:5′GCCGAATTCATGAGCA CGAATCCTAAACCT3′；②引物P2: 5′GCGTCGACTTAGGCTGAAGCGGGCACAGT3′. PCR反应条件为：94℃ 30 s, 55℃ 60 s, 72℃ 60 s, 30个循环.
1.2.2PCR产物克隆及鉴定纯化的PCR产物用EcoRI和SalI双酶切，定向克隆入pUC19质粒，转化大肠杆菌DH5α，进行蓝白筛选. 酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆命名为pUC19核心蛋白，进行序列分析.
1.2.3构建及鉴定诱饵载体用EcoRI， SalI酶切pUC19核心蛋白和表达载体pGBKT7, 回收核心蛋白及pGBKT7载体片段，载体片段与插入片段连接后转化大肠杆菌DH5α. 经限制性内切酶分析，含正确插入片段的克隆命名为pGBKT7核心蛋白.
1.2.4转化酵母感受态细胞在1.5 mL微量离心管中，加入已构建好的诱饵载体0.1 μg，鲱鱼精DNA 0.1 mg和0.1 mL酵母感受态细胞. 混匀后加入0.6 mL PEG/LiAc溶液. 在30℃以200 r/min振荡培养30 min, 加入70 mL DMSO后混匀, 在42℃水浴15 min, 冰浴2 min, 5000 r/min离心5 s,去上清，以0.5 mL 1×TE重悬细胞后，铺于SD/Trp平板. 于30℃培养36 h左右，直至带有诱饵载体的酵母克隆长出.
1.2.5蛋白表达的检测
1.2.5.1酵母全菌蛋白的抽提挑取几个已转化的酵母菌在5 mL SD/Trp培养液振荡培养过夜, 次日转接于50 mL SD/Trp培养液, 在30℃以230 r/min振荡培养至A600 nm=0.4～0.6. 在4℃，1000 r/min离心收菌. 将菌体置于液氮中冻存. 以60℃的裂解缓冲液200 μL融解菌体, 混匀后加入0.2 g玻璃珠, 70℃孵育10 min, 剧烈混旋1 min, 在4℃，5000 r/min离心5 min. 上清转移至新的Eppendorf管备用. 沉淀在100℃水浴5 min，再剧烈混旋1 min，在4℃，5000 r/min离心5 min后，上清转移至上述的Eppendorf管内, 100 g/L SDSPAGE电泳分析.
1.2.5.2Western Blot实验酵母全菌蛋白经100 g/L SDSPAGE电泳, 以100 V, 45 min将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜，放入0.5 g/L Tween20的PBST中，洗膜5 min，封入含有封闭液（5 g/L脱脂奶粉）的塑料袋中，37℃缓慢摇动1 h. PBST洗膜15 min×4. 稀释一抗（HCV核心蛋白mAb 1∶500）于PBST中. 将膜封入含适当稀释一抗的塑料袋中，4℃过夜. 次晨PBST洗膜15 min×3. 稀释二抗（羊抗鼠IgG）液于PBST中（1∶3000），将膜封入含适当稀释二抗的塑料袋中，37℃ 1 h. PBST洗膜15 min×3. 在暗室中用滤纸将膜上液体吸干，在ECL反应混合液中反应2 min后，压X光片2～20 min，显影、定影. X光片观察、照相.
1.2.6报告基因表达的检测
1.2.6.1HIS3报告基因表达的检测用无菌牙签随机挑取酵母菌单个克隆，分别划线于有Trp, Ura, His, Leu营养缺陷的SD平板上，于30℃培养36 h，观察酵母菌的生长情况.
1.2.6.2lacZ报告基因表达的检测①采用β半乳糖苷酶印膜法检测lacZ报告基因的表达. 用无菌牙签随机挑取酵母单个克隆，点样于硝酸纤维素滤膜上. 将带有酵母克隆的滤膜在液氮中迅速冷冻5 s后，置于室温裂菌. 将点有菌体的滤膜面朝上，放在另一张同样大小浸有Z buffer/Xgal的Whatman#1滤纸上，赶尽气泡，于30℃孵育30 min～8 h，观察颜色变化. ②采用诱饵载体转化酵母菌AH109后铺SD/Trp/Xagal平板检测lacZ报告基因的表达. 将诱饵载体转化酵母菌AH109后铺SD/Trp/Xagal平板，于30℃培养36 h，观察平板上菌落颜色的变化.
2结果
2.1核心蛋白基因片段编码区的扩增扩增出与预期大小一致的cDNA片段（图1）. 核心蛋白大小为588 bp.
2.2重组pUC19核心蛋白质粒的酶切鉴定及序列分析鉴定正确的pUC19核心蛋白重组质粒分别作正反向测序，序列分析表明所扩增的核心蛋白基因序列与登录的HCV核心蛋白基因序列完全一致（图2）.
2.3重组pGBKT7核心蛋白质粒的酶切分析见图3.
2.4Western Blot检测蛋白的表达在Mr为19×103可见明显目的条带且无杂带（图4）.
2.5HIS3报告基因表达的检测可见单纯AH109酵母菌只在SD/Ura平板上生长，而含有pGBKT7核心蛋白质粒的AH109酵母菌可以在SD/Ura和SD/Trp平板上生长，但所有克隆在SD/His和SD/Leu平板上均不生长.
2.6LacZ报告基因表达的检测含有HCV核心蛋白的酵母细胞显色中可见LacZ报告基因没有被HCV 核心蛋白激活(图5). 当LacZ报告基因被激活时β半乳糖苷酶大量表达，活性增高，在Xagal存在时，菌落显深蓝色，且扩散面积较大.
3讨论
酵母双杂交技术是目前应用较多的钓取与已知蛋白直接相互作用分子的方法［5］. 我们在酵母双杂交Gal4系统3基础上成功构建了融合有HCV核心蛋白的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白，再将含HCV核心蛋白的重组质粒转化入Ura缺陷生长的AH109酵母菌中. 通过Trp，Leu及His缺陷的营养筛选表明，带Trp营养筛选标记的重组表达质粒pGBKT7核心蛋白已成功转化入带有Ura 营养筛选标记的AH109酵母菌中. 带有重组表达质粒的AH109酵母菌在His营养缺陷的SD培养基上不能生长，说明构建的HCV核心蛋白对HIS3基因无激活作用. 同时β半乳糖苷酶印膜法及平板法检测结果也表明构建的HCV核心蛋白对LacZ基因无激活作用. 说明HBV核心蛋白对AH109无毒性，且对报告基因无自激活作用. 这与体外构建质粒共转染实验已经证明的结果相似. 这样，我们就能利用核心蛋白为诱饵，从人cDNA文库中去钓取与其相互作用的蛋白.
HCV 核心蛋白除了作为核壳蛋白具有病毒颗粒组装功能外，还具有多种调控细胞、病毒基因表达及细胞生长以及免疫调节等功能. 临床和实验研究显示HCV感染与HCC发生发展过程密切相关，其中病毒核心蛋白起到重要的作用［6］. 早期研究认为，HCV属于非整合性RNA病毒，与产生两种确定作用的反式激活子（X和截短的preS/S）的HBV不同，并不存在直接致癌的病毒蛋白. 后来研究证实核心蛋白也是一种反式激活蛋白，其作用甚至超过X蛋白［7］. 核心蛋白对细胞信号转导途径，尤其是NFκB，AP1和SRE相关途径具有明显的增强作用［8］；在HeLa和HepG2细胞系中HCV核心蛋白与TNFR1胞质区相互结合，影响TNFR1的信号传递，增加了TNF诱导的细胞凋亡，与细胞增殖、分化及慢性炎症形成等有关［9］. 在HepG2细胞中，核心蛋白激活人类cmyc基因、RSV LTR和SV40早期启动子［10］；HCV核心蛋白与p53协同破坏宿主细胞的完整性，干扰抗原递呈和免疫反应, 逃避各种非抗原特有效应因子清除HCV感染肝细胞，使病毒得以复制［11］.
目前的研究表明，病毒编码的蛋白对宿主细胞生长的调节作用可能是HCV致癌的主要因素. HCV核心蛋白是一种重要的转录激活因子，能够反式激活同源/异源的病毒/细胞转录调节序列，对HCV的慢性化和促进肝细胞的转化有密切的关系. 我们拟利用核心蛋白作为诱饵，从人肝cDNA文库中去钓取与其相互作用的蛋白，以期对其功能有进一步了解.
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