[ICSI在常规体外受精失败后卵子再受精中的应用] 卵子

【摘要】 目的 探讨卵细胞浆内单精子注射(ICSI)技术在常规体外受精失败后卵子再受精中的有效性。方法 在12个体外受精失败周期中应用ICSI对未受精的MⅡ期卵子进行再受精,将获得的优质胚胎冷冻保存,选择适当时机复温后移植,移植前均行胚胎辅助孵化。结果 106个未受精的成熟卵子接受ICSI,注射后92个卵子存活。其中75个卵子正常受精,受精率为70.8%(75/106);12个卵子出现三原核或单原核。69个正常受精卵发生分裂,卵裂率为92.0%(69/75)。最后获得优质胚胎58个,冻融后共移植胚胎38个,其中1个周期的7个冻融胚胎均破碎而未移植,其余11个周期均有可供移植的胚胎。1例孕3月时流产,1例单胎临床妊娠分娩出正常婴儿,临床妊娠率为18.2%。结论 ICSI使常规体外受精失败的卵子再受精,配合胚胎冻融及辅助孵化技术实现临床妊娠,具有一定的应用价值。

【关键词】 卵细胞浆内单精子注射 受精 体外 妊娠

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the application of intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in human oocyte reinsemination after failure of conventional in vitro fertilization (IVF).MethodsReinsemination via ICSI was carried out on MⅡ oocytes (No.=106) after 12cycle failure of conventional IVF. The best embryos were frozen and transplanted after thawing and assisted hatching (AH). ResultsNinetytwo MⅡoocytes received ICSI were survived among which normal fertilization was found in 75 oocytes (75/106, 70.8%), cleavage in 69 oocytes (69/75, 92.0%). Polyploidic (or monoploidic) oocytes were found in 12 oocytes, 57 best embryos were freezethawing, of which 38 could be transferred to 11 women. One embryo failed to be transplanted, seven embryos were damaged seriously during transplantation. One patient conceived two twins clinically after ET, and another biochemically. The pregnancy rate was 18.2%.ConclusionICSI could be used to reinseminate the oocytes from the failed fertilization cycles in vitro. It has some efficacy of obtaining pregnancy with the help of freezethawing and assisted hatching of embryos.

[KEY WORDS]intracytoplasmic sperm injection; fertilization in vitro; pregnancy

2003年3月~2006年2月,我中心对12个常规体外受精失败周期,应用卵细胞浆内单精子注射(ICSI)技术使卵子再受精,配合辅助孵化及胚胎冻融技术实现临床妊娠2例。本文旨在探讨ICSI在体外受精失败后的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

12对不孕夫妇均为原发性不孕,其中输卵管性因素7例,子宫内膜异位症3例,排卵障碍2例。男方精液常规检查均正常。女方平均年龄29.0岁,男方平均年龄31.8岁。不孕时间平均为4.5年。

1.2 方法

女方常规超促排卵,阴道B超下行卵泡抽取术获卵。收集的卵子用含体积分数0.10灭活人血清的HTF培养液洗涤后培养备用。男方手淫法采集精液,置于清洁无菌的容器内。常规检查后,采用上游法处理精液备用。

卵子培养4~6 h后行体外受精,受精16~18 h后剔除卵丘细胞,观察卵子受精情况。外观正常无明显卵细胞退化迹象、无雌雄原核的MⅡ期卵子即为受精失败的卵子。立即按卵细胞浆内单精子注射的程序进行“再受精”补救。注射后的卵子转移至P1培养液中培养,20 h后观察卵子受精情况。含有2个清晰可见的雌雄原核的卵子为正常受精卵,将其转移至含体积分数0.10血清的新鲜P1培养液中继续培养,24 h后观察受精卵分裂情况,优质胚胎进行冷冻保存。

选取适当时机进行冻融胚胎移植。移植前均行透明带机械性切割以帮助胚胎孵出。移植后2周查 血清βhCG,阳性表示生化妊娠。移植后7周B超检查妊娠囊数目及胎心搏动情况,判断是否为临床妊娠。

2 结 果

12对不孕夫妇共获取118个卵子,其中受精失败的MⅡ期卵子106个,MⅠ期卵子8个,GⅤ期卵子2个,退化卵子2个。对106个成熟的未受精卵均行卵母细胞内单精子注射,注射后存活卵子92个,存活率为86.8%。其中双原核卵子75个,三原核卵子9个,单原核卵子3个,无核卵子5个,正常受精率为70.8%(75/106),异常受精率为11.3%(12/106)。69个正常受精卵发生分裂,卵裂率为92.0%(69/75),最后获得优质胚胎58个。

胚胎冻融后可供移植的胚胎数目为38个,其中11个周期均有可供移植的胚胎,1个周期有7个冻融胚胎均破碎而未予移植。2例获得临床妊娠,其中1例孕3月时流产,1例为单胎临床妊娠足月分娩出正常婴儿,临床妊娠率为18.2%。

3 讨 论

自1978年英国诞生了世界上第一例试管婴儿以来,传统的体外受精胚胎移植术(IVFET)已经发展成为一种比较成熟的辅助生殖技术。严格掌握适应证,可以获得较高的受精率,但是某些难以预料的因素时常使卵子遭遇部分或全部的受精失败。

ICSI以较少的精子需求和较高的受精率成为辅助生殖技术发展史上的又一个里程碑[1],适用于严重的少弱精病人,甚或能从睾丸或附睾获取精子的无精子症病人。近年来,已有卵细胞浆内单精子注射使体外受精失败的卵子再受精并获得临床妊娠的报道,但是卵子老化、透明带变性以及胚胎发育与子宫内膜的不同步等因素降低了卵子的再受精率和胚胎种植率。

卵子的自然受精包括精卵融合、卵子激活、第二极体排出、雌雄原核形成等一系列生物学过程。许多因素可以造成体外受精失败,其中最主要的原因是精卵结合障碍,这也是通过ICSI技术使卵子再受精的理论基础。有资料表明,体外受精失败后48 h的卵子仍有再受精的能力,但卵龄越长,再受精率越低[2]。影响再受精的因素有卵子的老化和再受精的方法,简单重复的第二次受精的成功率仅为8.3%,而ICSI的受精率高达76.9%[3]。

到目前为止,还没有一种比较好的方法能够直接检测出配子的受精能力。精液的常规检查只能对精子的质量进行初步的评估。去透明带金黄地鼠卵穿透试验也仅能提供部分参考。较为理想的方法是人类配子的透明带结合实验,但是成熟的人卵母细胞较难获得,这种检测方法尚不能广泛开展。鉴于卵细胞浆内单精子注射具有较高的受精率,为避免体外受精失败,有学者提出将其作为一种常规手术方法来采用,尤其是对原发性不孕的病人。国内庄广伦教授认为,卵细胞浆内单精子注射是一种侵袭性手术,它对卵子遗传物质的改变具有不确定性。除非病人确实具有严重的少弱畸精等适应证,否则不能作为常规方法使用。因此,体外受精失败后行ICSI再受精作为一种补救措施,具有一定的临床应用价值。

本研究中共对106个卵子进行了再受精补救,其中有75个卵子正常受精(70.8%),有12个三原核或单原核卵子。出现三原核的原因可能是卵子受精后第二极体未排出或基因组发生复制;产生单原核的原因可能是未注射精子前排出第二极体而发生了孤雌受精现象。与本生殖中心正常的ICSI相比较,再受精率无明显差异,然而异常受精率明显升高(6.8%,11.3%),这可能与卵子的老化以及卵子长时间暴露在有毒性代谢产物的培养基内有关[4]。再受精的时机仍有争议,尽早进行ICSI,可能降低异常受精的发生率。

再受精后的胚胎种植率情况,各家报道的结果有很大的差别。卵子在体外培养时间的延长使透明带变硬,增加胚胎孵化的难度。由于受精过程的延迟,使得胚胎发育与子宫内膜的周期不同步,直接影响了胚胎的着床。我们采取了胚胎冻融技术,在下一个月经周期选择适当的时机进行胚胎移植,尽可能使胚胎发育与子宫内膜的周期同步,同时所有移植的胚胎均行透明带机械性切割以帮助胚胎孵出。本实验结果显示,胚胎移植后的妊娠率为18.2%,略高于同类研究水平,但仍低于本中心正常ICSI的妊娠率(38.8%)。可能与老化的卵子再受精后胚胎染色体异常的比例升高有关。胚胎冻融增加了胚胎损伤的风险,本实验中有1例病人的所有胚胎(7个)在冻融后均破碎。冷冻损伤可能与胚胎的“耐冻性”有关,成熟的冻融技术也是提高胚胎冷冻复温后存活率的保证。

国外已有资料报道,移植了ICSI再受精后冻融的胚胎,可以分娩出正常的婴儿[5]。我们的研究也获得了18.2%的临床妊娠率,并分娩1例健康活婴,因此作为一种补救措施,未受精卵子的ICSI再受精能够最大限度地减少病人的痛苦,具有很大的应用价值。但是随着卵细胞的老化,细胞遗传异常的机会增加,流产率明显升高。为避免遗传缺陷儿的出生,应积极开展种植前遗传学诊断(PGD)及胎儿的产前检测工作。

【参考文献】

[1]PALERMO G D, JORIS H, DEVROEY P, et al. Pregnancies after intracytoplasmic injection of a single spermatozoon into an oocyte[J]. Lancet, 1992,340:1719.

[2]CHEN C, KATTERA S. Rescue ICSI of oocytes that failed to extrude the second polar body 6 h postinsemination in conventional IVF[J]. Hum Reprod, 2003,18(10):21182121.

[3]李蓉,庄广伦,周灿权,等. 体外培养24小时受精失败卵母细胞单精子显微注射再受精的观察[J]. 中华妇产科杂志, 2000,35(7):404405.

[4]PELLESTOR F, ANDREO B, AMAL F, et al. Maternal aging and chromosomal abnormalities:new data drawn from in vitro unfertilized human oocytes[J]. Hum Genet, 2003,112:195203.

[5]LOMBARDI E, TIVERON M, INZA R, et al. Live birth and normalyear followup of a baby born after transfer of cryopreserved embryos from rescue intracytoplasmic sperm injection of 1dayold oocytes[J]. Fertil Sterll, 2003,80(3):646648.