【摘要】 目的 探讨肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜组织中肿瘤坏死因子α（TNFα）和血管活性肠肽（VIP）的表达及意义。方法 健康Wistar大白鼠60只，随机分为实验组、对照组和正常组，每组20只。实验组通过手术用无损伤动脉夹夹闭肠系膜上动脉起始部，1 h后松夹恢复肠系膜上动脉血流制成肠缺血后再灌流模型；对照组只进行同样腹部手术操作但不夹闭肠系膜上动脉；正常组不手术。6 h后处死动物，取距回盲部15 cm处肠管1 cm，常规组织切片，通过苏木精伊红染色观察肠黏膜组织细胞学形态；采用免疫组织化学方法染色显示肠黏膜组织或细胞中肿瘤坏死因子α（TNFα） 和血管活性肠肽（VIP）的表达情况，使用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果 光镜下，实验组与对照组相比肠壁变薄，上皮细胞水肿明显，中性粒细胞及淋巴细胞浸润，实验组肠黏膜上皮细胞胞浆及基质TNFα表达较其他组增高（F=11.32，P<0.01）；肠黏膜上皮细胞内血管活性肠肽表达较其他组增高（F=9.62， P<0.05）。结论 TNFα和VIP表达升高与肠损伤有关，纠正TNFα和VIP的平衡，可对临床预防和治疗肠损伤的发生提供新的方法。
【关键词】 再灌注损伤 肠屏障 肿瘤坏死因子α 血管活性肠肽
［ABSTRACT］ObjectiveTo explore the expression and its significance of tumor necrosis factor alpha (TNFα ) and vasoactive intestinal peptide (VIP) in impaired intestinal mucosa.MethodsSixty healthy Wistar rats were evenly randomized to study, control and normal group. For study group, a model of postischemicreperfusion intestine was established by clamping the superior mesenteric artery; for control group, a laparotomy was merely done; for those in normal control group, no operation was done. An 1 cm long segment of intestine, 15 cm above ileocecal junction, was dissected 6 hours later, and a tissue section made. Immunohistochemical study was used to observe the expression of TNFα and VIP and VIDAS image analysis system applied for semiquantitative detection.ResultsThin enteric wall, edematous epithelium with neutrophils and lymphocytes infiltration, and short intestinal villi were obviously noticed in the study group compared with the other two. Immunohistochemically, the expression of TNFα and VIP in the study group was higher than that of the other two.ConclusionThe raising expression of TNFα and VIP is associated with the damage of intestine. Clinically, balancing TNFα and VIP may provide a new way to protect and treat intestinal impairment.
［KEY WORDS］reperfusion injury; intestinal barrier; tumor necrosis factor alpha; vasoactive intestinal peptide
机械屏障是肠道屏障的重要组成部分,同时也是诸如免疫屏障、生物屏障等其他肠道屏障的物质基础，因而机械屏障是肠屏障功能维持的关键。机械屏障由肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接等构成[1]。基质金属蛋白酶等可特异性分解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及层粘连蛋白，从而影响到肠屏障功能的维持，多种细胞因子可调节基质金属蛋白酶活性。本研究通过制备大鼠肠缺血再灌注损伤模型，观察对基质金属蛋白酶有调节作用的肿瘤坏死因子α（TNFα）和血管活性肠肽（VIP）的变化，探讨它们在肠屏障损伤中所起的作用。
1 材料与方法
1.1 材料来源
健康Wistar大白鼠60只，购于青岛市实验动物中心，雌雄不限。随机分为实验组、对照组和正常组，每组20只。
1.2 手术方法
动物适应性喂养1周。手术前12 h禁食，自由饮水。常规腹腔注射麻醉，暴露肠系膜上动脉，实验组在显微手术下用无损伤动脉夹夹闭系膜上动脉起始部。无菌生理盐水纱布覆盖切口，旁照灯照射保
6期李伟华. 肠缺血再灌注损伤大鼠肠黏膜组织中TNFα和VIP的表达及意义511
暖。1 h后松开动脉夹恢复肠系膜上动脉血流，依次关闭切口。对照组只进行同样操作但不夹闭肠系膜上动脉。正常组不手术。手术后大鼠分笼饲养。
1.3 动物及标本处理
6 h后处死动物，取距回盲部15 cm处的肠管1 cm，常规石蜡包埋，组织切片，通过苏木精伊红染色（HE）观察肠黏膜组织细胞学形态；应用免疫组织化学方法染色显示TNFα和VIP表达情况；使用OLYMPAS BX50多功能显微镜，选取不同视野观察并照相。运用显微图像分析系统（VIDAS）在每张切片上随机选出黏膜内的两个视野进行计算机显微图像分析，测得其平均吸光度值，结果用±s表示，所得数据利用SPSS 10.0统计学软件进行方差分析。
2 结 果
2.1 HE染色
对照组和正常组肠壁组织均匀，绒毛上皮细胞排列规整。实验组可见肠壁变薄，上皮细胞水肿明显，部分坏死脱落，小肠绒毛短细，绒毛间距变宽；中性粒细胞及淋巴细胞浸润，个别肠黏膜固有层内腺体灶性区域坏死。
2.2 TNFα免疫组化染色及半定量分析
实验组绒毛上皮细胞胞浆内棕色颗粒明显，基质中也布满了棕色颗粒，总体染色范围大、染色深。正常组绒毛上皮细胞胞浆内也有棕色颗粒，但是染色较浅，基质中棕色颗粒的范围明显较小、染色浅。对照组介于实验组和正常组之间，染色也较浅。实验组平均吸光度值为0.45±0.02，对照组为0.27±0.02，正常组为0.26±0.02，实验组平均吸光度值与其他组比较差异有显著性（F=11.32，P<0.01）。 2.3 VIP免疫组化染色及半定量分析
VIP的阳性染色在细胞核内,它不仅存在于肠黏膜上皮细胞内,而且也存在于黏膜下固有层中。实验组可见局灶性表达，较对照组、正常组染色深。对照组与正常组只有少量表达，且染色较浅。实验组平均吸光度值为0.14±0.03，对照组为 0.11±0.02，正常组为0.10±0.04。实验组平均吸光度值与其他组比较差异有显著性（F=9.62，P<0.05）。
3 讨 论
肠缺血再灌注是应激状态中必经的病理生理过程[2]。目前认为，肠黏膜低灌注、氧自由基损伤及细胞因子作用是肠黏膜三大主要致伤因素[3]。由于缺血，肠系膜血流量下降，引起肠微绒毛低灌注，氧供减少，导致黏膜水肿。严重时出现肠上皮细胞坏死、微绒毛分离及固有层崩解。另外，缺血后再灌注时，通过氧自由基的大量生成，进一步损伤肠黏膜。由此而产生的肠黏膜萎缩及通透性增大，导致肠屏障功能损伤、肠源性细菌毒素进入血液而引发失控的炎症反应和脓毒症,是导致多脏器功能障碍综合征的重要原因[4]。
本研究中观察到实验组肠黏膜组织中TNFα表达较对照组和正常组明显增高。TNFα主要由单核细胞巨噬细胞和活化的T淋巴细胞产生，其引起肠道黏膜损伤的可能机制包括释放血小板活化因子、生成白三烯和氧自由基、诱导一氧化氮合成酶异构体,从而产生大量一氧化氮引起细胞损伤。当肠道发生炎症时,肠道炎性细胞高表达一些如TNFα等炎症因子[5]。肠上皮细胞受这些炎症因子刺激后分泌一些促炎性细胞因子如IL8,上皮细胞所分泌的细胞因子能趋化肠黏膜固有层炎性细胞,放大免疫反应[6]。同时，这些细胞因子可以促进肠黏膜细胞分泌基质金属蛋白酶类（MMPs），并能显著性上调MMP13/TIMP1比值[7]，抑制肠黏膜细胞分裂和蛋白聚糖的合成，刺激生成MMP13，引起基质降解，促进肠屏障损害的发生。
作为一种保护性细胞因子，VIP在肠缺血再灌注中起保护作用。VIP能够调节蛋白聚糖的代谢和促进胶原、氨基聚糖的合成，在人类肠黏膜细胞中能够增加MMPs组织抑制因子TIMP1的表达，是肠黏膜细胞中MMPs的负向因子和TIMP1的调节剂，并且VIP能拮抗TNFα，起到下调MMPs的作用。同时，VIP还能抑制内源性激活剂血纤维蛋白溶酶激活剂的分泌，阻碍MMPs的活化，并促进血纤维蛋白溶酶激活物抑制物的合成，以此降低MMPs的激活速度。本研究结果显示，实验组大鼠肠黏膜VIP表达较对照组和正常组增高，但是VIP增高没有TNFα显著。也就是说TNFα和VIP的比例失调，最终可导致MMP13的高表达，使肠黏膜受损，通透性增加，肠屏障受损。
【参考文献】
[1]MACFIE J, O’BOYLE C, MITCHELL C J, et al. Gut origin of sepsis: a prospective study investigating associations between bacterial translocation, gastric microflora, and septic morbidity[J]. Gut, 1999,45(2):223228.
[2]刘海光,杜丹,伦明辉,等. 缺血再灌注损伤降低肠黏膜屏障功能的初步研究[J]. 大连医科大学学报， 2004，26（1）：1719.
[3]赵钢,江伟,徐惠芳. 大黄对肠缺血再灌注致大鼠炎症反应的防治作用[J]. 南京铁道医学院学报, 2000,19(4):246248.
[4]吕艺,黎君友,孙世荣,等. 肠缺血再灌流大鼠血浆二胺氧化酶活性的变化与肠损伤的关系[J]. 氨基酸与生物资源, 2000,22(4):5054.
[5]刘桂海. 新生儿肠闭锁的手术治疗效果[J]. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4)：337338.
[6]REINECKER H C, STEFFEN M, WITTHOEFT T, et al. Enhanced secretion of tumour necrosis factoralpha, IL6, and IL1 beta by isolated lamina propria mononuclear cell from patients with ulcerative colitis and Crohn’s disease[J]. Clin Exp Immunol, 1993,94(1):174.
[7]WIRTZ A T, MCCORMICK B, NEISH A S, et al. Pathogeninduced chemokine secretion from model intestinal epithelium is inhibited Lipoxin A4 analogs[J]. Clin Invest, 1998,101(9):1860.